Zastosowanie nieniszczącej spektroskopii Ramana oraz technologii analitycznej procesu (PAT) do profilowania śladowych zanieczyszczeń w czasie rzeczywistym w botanicznych aktywnych substancjach farmaceutycznych
Abstrakt
Wprowadzenie
Botaniczne aktywne substancje farmaceutyczne (APIs) oraz botaniczne substancje lecznicze wymagają strategii jakościowych zdolnych do kontrolowania zmienności i zarządzania ryzykiem zanieczyszczeń przy użyciu podejścia opartego na „całości dowodów” (totality of the evidence), które obejmuje kontrolę botanicznego surowca oraz badania chemiczne, takie jak metody spektroskopowe i/lub chromatograficzne. [1] Wytyczne regulacyjne wyraźnie oczekują badań na obecność pozostałości pestycydów i toksyn przypadkowych (np. aflatoksyn), a także kontroli dotyczących materiałów obcych i substancji zafałszowujących, co motywuje do stosowania metod szybkiego skriningu, które można wdrożyć w całym łańcuchu dostaw i cyklu życia produkcji. [1]
Cel
Niniejsze badanie koncepcyjne typu proof-of-concept oraz synteza danych oceniają, w jaki sposób nieniszcząca spektroskopia Ramana (w tym warianty wzmocnione powierzchniowo — SERS) może zostać zintegrowana z ramami technologii analitycznej procesu (PAT) w celu profilowania śladowych zanieczyszczeń w botanicznych APIs w czasie rzeczywistym lub zbliżonym do rzeczywistego, ze szczególnym uwzględnieniem wykonalności, wydajności analitycznej i ograniczeń wdrożeniowych popartych opublikowanymi dowodami. [2, 3]
Metody
Zsyntetyzowaliśmy dowody wykazujące:
- czułość metody Ramana na strukturę chemiczną i minimalne wymagania dotyczące przygotowania próbek; [2, 4]
- wzmocnienie SERS i reprezentatywne prezentacje wykrywania śladowych ilości pestycydów (w tym reżimy od ppm do sub-ppb); [5–8]
- strategie chemometryczne do uwierzytelniania zafałszowań i przewidywania ilościowego; [9–11]
- przykłady monitorowania procesów zgodne z PAT oraz znane bariery w translacji przemysłowej. [3]
Wyniki
W zestawionych badaniach spektroskopia Ramana i chemometria pozwoliły na rozróżnienie zafałszowanych olejków eterycznych w sytuacjach, gdy inspekcja wizualna była niewystarczająca, przy czym PCA zapewniło separację spektralną między próbkami czystymi a zafałszowanymi. [9] Ilościowe modelowanie ramanowskie (PLSR) pozwoliło uzyskać wysoki poziom dokładności predykcji w zadaniach przewidywania stężeń, co potwierdza zasadność kwantyfikacji opartej na kalibracji w złożonych recepturach. [10]
W przypadku zanieczyszczeń śladowych, badania SERS wykazały wykrywalność wybranych pestycydów na powierzchni owoców na poziomie 1 ppm, a w innych pracach zmierzono LODs w zakresie 0.001–10 ppm dla 21 pestycydów przy użyciu koloidalnych nanocząstek złota. [6, 7] Ręczne urządzenia SERS z ekstrakcją octanową QuEChERS wykryły wiele pestycydów poniżej unijnego MRL wynoszącego 10 ppb w ryżu basmati dla wybranych analitów, przy czym ekstrakcję zakończono w czasie krótszym niż 15 min, co ilustruje pragmatyczny przepływ pracy typu „najpierw skrining”. [8]
W zastosowaniach PAT, szybkie, nieniszczące i nieinwazyjne pomiary ramanowskie oraz możliwość ich wdrożenia od laboratorium po linie produkcyjne wspierają monitorowanie inline/online. Jednak dowody podkreślają również, że większość badań nad PAT pozostaje w skali laboratoryjnej, a modele procesowe Ramana mogą charakteryzować się stosunkowo wysokimi LODs, które uniemożliwiają wykrycie celów o niskim stężeniu w warunkach monitorowania ekstrakcji. [2, 3]
Wnioski
Dowody potwierdzają wykonalność koncepcji PAT opartej na technologii Raman/SERS w zarządzaniu ryzykiem zanieczyszczeń botanicznych APIs: wdrożenie przenośnych urządzeń Ramana do autentykacji materiałów przychodzących i skriningu zafałszowań; wykorzystanie modułów SERS do celowanego skriningu pestycydów; oraz integrację modeli wielowymiarowych opartych na spektroskopii Ramana w pętle kontrolne PAT, gdzie warunki procesu pozwalają na stabilny transfer kalibracji i odpowiednią zdolność detekcji. [3, 12]
Głównymi ograniczeniami są czułość w przypadku celów ultra-śladowych w heterogenicznych matrycach botanicznych, fluorescencja i słabe sygnały ramanowskie, a także wymagania dotyczące walidacji i transferu modeli niezbędne do akceptacji regulacyjnej podejść opartych na ograniczonych badaniach lub badaniach wyrywkowych (skip testing). [3, 4, 13]
Słowa kluczowe
- Spektroskopia Ramana
- SERS
- Technologia analityczna procesu (PAT)
- Botaniczne API
- Pozostałości pestycydów
- Wykrywanie zafałszowań
- Chemometria
- Monitorowanie w czasie rzeczywistym
Wprowadzenie
Botaniczne substancje lecznicze i botaniczne APIs są regulowane w ramach paradygmatów jakościowych, które kładą nacisk na spójność terapeutyczną wspieraną przez podejście „całości dowodów”, w tym kontrolę surowca botanicznego i badania kontroli jakości chemicznej, które mogą wykorzystywać metody spektroskopowe i/lub chromatograficzne. [1] W ramach tego paradygmatu ryzyko zanieczyszczenia i zafałszowania jest wyraźnie wskazane jako kwestia jakościowa wymagająca strategii badawczych, w tym testów na pozostałości pestycydów (w tym pestycydów macierzystych i głównych toksycznych metabolitów) oraz toksyn przypadkowych, takich jak aflatoksyny, a także kontroli dotyczących materiałów obcych i substancji zafałszowujących. [1]
Równolegle, europejskie wytyczne dotyczące specyfikacji substancji i przetworów roślinnych definiują specyfikacje jako testy, procedury i kryteria akceptacji stosowane w celu zapewnienia jakości przy zwalnianiu serii oraz w okresie trwałości, a także identyfikują grupy zanieczyszczeń, które powinny być odpowiednio monitorowane, w tym metale ciężkie/zanieczyszczenia pierwiastkowe, pozostałości pestycydów i fumigantów, mikotoksyny (aflatoksyny, ochratoksyna A) oraz zanieczyszczenia mikrobiologiczne. [13, 14] Wytyczne EMA wskazują również, że okresowe badania wyrywkowe (skip testing) pozostałości zanieczyszczeń mogą być dopuszczalne, gdy są uzasadnione oceną ryzyka i danymi z serii, ustanawiając wyraźną zachętę regulacyjną do stosowania szybszych narzędzi skriningowych i narzędzi służących zrozumieniu procesu, które mogą uzasadnić strategie kontroli oparte na ryzyku bez uszczerbku dla bezpieczeństwa. [13]
Spektroskopia Ramana jest kandydatem do takich strategii, ponieważ rozproszenie ramanowskie zapewnia specyficzne chemicznie widma typu „fingerprint”, a metody ramanowskie są powszechnie określane jako szybkie, nieniszczące i nieinwazyjne, z prostym przygotowaniem próbki, co stanowi cechy operacyjne zgodne z podejmowaniem decyzji w czasie rzeczywistym podczas produkcji i kontroli łańcucha dostaw. [2, 4]
Przeglądy zastosowań ramanowskich w farmacji opisują zakres wdrożenia rozciągający się od zastosowań laboratoryjnych po doki przeładunkowe i linie produkcyjne, co sugeruje, że spektroskopię Ramana można uważać nie tylko za narzędzie identyfikacji off-line, ale także za potencjalny czujnik analityczny w procesie w kontekście PAT. [2] PAT jest wyraźnie zdefiniowana jako wykorzystanie serii narzędzi i środków do realizacji analizy w czasie rzeczywistym i sterowania ze sprzężeniem zwrotnym podczas produkcji przemysłowej w celu zapewnienia kontrolowanego procesu produkcji i optymalnej jakości produktu, a techniki spektroskopii oscylacyjnej są opisywane jako umożliwiające online, w czasie rzeczywistym i szybkie wykrywanie wewnętrznych atrybutów jakości ziół podczas przetwarzania. [3]
Jednak profilowanie śladowych zanieczyszczeń w produktach botanicznych jest wymagające analitycznie, a literatura wskazuje na istotne wyzwania translacyjne: większość badań PAT została przeprowadzona na sprzęcie w skali laboratoryjnej, gdzie warunki eksperymentalne są łatwiejsze do kontrolowania, a modele procesowe oparte na spektroskopii Ramana mogą mieć stosunkowo wysokie LODs, które nie pozwalają na wykrycie celów o niskim stężeniu w symulowanych zadaniach monitorowania ekstrakcji. [3] Ograniczenia te motywują do postawienia pytania projektowego dla botanicznych APIs: w jaki sposób spektroskopia Ramana (i SERS) może zostać wdrożona w ramach PAT, aby zapewniała szybki, nieniszczący skrining i, tam gdzie to możliwe, ilościowe prognozy odporne na zmienność matrycy i procesu, pozostając jednocześnie w zgodzie z opartymi na ryzyku oczekiwaniami regulacyjnymi dotyczącymi kontroli zanieczyszczeń i walidacji metod? [2, 3, 13]
W związku z powyższym, analizowane pytanie badawcze brzmi: Czy opublikowane dowody na wydajność metod Raman i SERS mogą wspierać praktyczną architekturę PAT dla profilowania śladowych zanieczyszczeń w botanicznych APIs w czasie zbliżonym do rzeczywistego, która uzupełnia lub selekcjonuje klasyczne oznaczenia potwierdzające? [3, 6, 8] Hipoteza robocza zakłada, że nieniszcząca identyfikacja ramanowska będzie najskuteczniejsza jako wielopoziomowy system PAT: (i) Raman + chemometria do szybkiej autentykacji/skriningu zafałszowań; (ii) celowane moduły SERS do wykrywania śladowych ilości pestycydów w odpowiednich matrycach; oraz (iii) monitorowanie procesowe ramanowskie wewnętrznych atrybutów jakości tam, gdzie czułość jest odpowiednia, z uzasadnionym badaniem wyrywkowym (skip-testing) opartym na ryzyku, wynikającym z danych i historii serii, a nie z samego wdrożenia czujnika. [3, 6, 9, 13]
Ilościowe przewidywanie i wnioskowanie oparte na kalibracji
W celu ilościowego przewidywania i wnioskowania opartego na kalibracji, badanie ramanowskie preparatów eugenolu metylowego zafałszowanych ksylenem wykazało, że PCA było użyteczne do różnicowania zestawów danych widm Ramana o różnych stężeniach. Dodatkowo, model PLSR był w stanie przewidzieć stężenie nieznanej próbki z dużą wiarygodnością, co udowodniło, że połączenie spektroskopii Ramana i PLSR może zapewnić wysoką wydajność predykcyjną. Podkreśla to potencjalną użyteczność w opracowywaniu modeli ilościowych dla substancji zafałszowujących o znanym ryzyku w botanicznych APIs, gdy dostępne są materiały referencyjne [10].
Potwierdzenie tożsamości w produktach gotowych
Metoda ramanowska oparta na kodach kreskowych okazała się skuteczna w potwierdzaniu tożsamości APIs w produktach gotowych. Technika ta polega na porównaniu procentowego niezerowego nakładania się oczekiwanych kodów kreskowych API i gotowego produktu leczniczego, gdzie widma są przekształcane w celu podkreślenia pików Ramana [11]. Wykorzystując to podejście, 18 zatwierdzonych gotowych produktów leczniczych i dziewięć symulowanych podróbek zidentyfikowano ze 100% dokładnością. Wspiera to wykonalność stosowania logiki „nakładania się fingerprintów” opartej na metodzie Ramana do solidnej weryfikacji tożsamości w produktach sformułowanych, pod warunkiem zastosowania odpowiednich reguł transformacji i decyzyjnych [11].
Analiza ramanowska pod kątem ryzyka botanicznych zamienników
Podejścia oparte na ramanowskich sygnaturach spektralnych zostały wdrożone w celu odróżnienia próbek autentycznych od zafałszowanych w kontekstach botanicznych. Na przykład, analiza próbek Phansomba/Phellinus ujawniła wyraźną separację między okazami autentycznymi a zafałszowanymi. Zidentyfikowano kluczowe pasma ramanowskie (487, 528, 786, 892, 915 i 1436 cm) charakterystyczne dla Phellinus (szczególnie Ph. merrillii), co sugeruje potencjał budowania baz danych zakresów sygnatur dla procesów inspekcji w przypadku innych leków ziołowych [21].
Istnieją jednak ograniczenia. W skriningu 50 ziołowych suplementów diety deklarowanych jako środki na poprawę potencji, spektroskopia Ramana wykryła dziewięć zafałszowanych próbek (cztery syldenofilem i pięć tadalafilem). Jednakże, nie dostarczyła ona jednoznacznych wyników dotyczących zafałszowania tadalafilem w dwóch próbkach, co wskazuje na potrzebę stosowania metod potwierdzających lub ulepszonych strategii interpretacji widm w niektórych przypadkach [22].
4.2 Pozostałości pestycydów metodą SERS
Opublikowane dowody podkreślają, że SERS jest szybką, nieniszczącą techniką zdolną do wykrywania pestycydów na poziomie śladowym (ppm lub ppb) w zgodzie ze standardami kontroli zanieczyszczeń botanicznych [1, 6, 19]. Jedno z badań wykazało zdolność SERS do wykrywania pestycydów na powierzchni owoców na poziomie tak niskim jak 1 ppm, co dobrze koreluje z regulacyjnymi limitami pozostałości pestycydów dla jabłek [6].
Ilościowe badania SERS wykazały wysoką wydajność kalibracji. Na przykład, w jednym z badań odnotowano współczynniki determinacji (R²) wynoszące 0.99 dla ometoatu i 0.98 dla chlorpiryfosu, z granicami wykrywalności (LODs) wynoszącymi odpowiednio 1.63 mg·cm i 2.64 mg·cm. Podkreśla to wykonalność modeli kalibracyjnych wykorzystujących charakterystyczne intensywności pików SERS do oznaczania ilościowego pozostałości [17]. W badaniu tym wykorzystano specyficzne dla analitów piki ramanowskie (413 cm dla ometoatu, 346 cm dla chlorpiryfosu) do mapowania stężeń poprzez modele kalibracyjne [17].
SERS z wykorzystaniem koloidalnych nanocząstek złota dodatkowo wzmocnił rozproszenie ramanowskie 21 różnych pestycydów. Granice wykrywalności wahały się od 0.001 do 10 ppm, przy czym jednoczesna identyfikacja fosmetu i tiramu została osiągnięta na skórce jabłka przy użyciu PCA i SERS [7].
W przypadku matryc warzyw liściastych, krzywe kalibracyjne dla pozostałości pestycydów fosmetu, tiabendazolu i acetamiprydu wykazały silne liniowe współczynniki korelacji, osiągając odzysk między 94.67% a 112.89%. Walidacje oparte na odzysku wykazały względne odchylenia standardowe między 3.87% a 8.56%. Cały proces testowania, w tym pobieranie próbek, analizę widma i prognozowanie ilościowe, został zakończony w mniej niż pięć minut, co stanowi znaczną poprawę w stosunku do tradycyjnych metod chromatograficznych [16].
W kontekście matrycy botanicznej, SERS wykazał potencjał w wykrywaniu deltametryny w Corydalis. Główny charakterystyczny pik zidentyfikowano przy 999 cm, a przyrosty w modelowaniu pozwoliły uzyskać granicę wykrywalności na poziomie 0.186 mg/L dla bezpośredniej obserwacji piku 999 cm. Zastosowanie modelu PLS pozwoliło również na uzyskanie dobrych parametrów wydajności predykcyjnej [23].
Ręczne urządzenia SERS, w połączeniu z ekstrakcją octanową QuEChERS, wykazały zdolność do wykrywania wielu pozostałości pestycydów w ryżu basmati w ciągu 15 minut. Pestycydy takie jak CBM, THI i TRI zostały wykryte poniżej unijnego maksymalnego limitu pozostałości (MRL) wynoszącego 10 ppb. Jednak granica wykrywalności dla ACE pozostała na poziomie 800 ppb, co podkreśla potencjalną zmienność czułości analitów w procesie analizy wielopozostałościowej [8].
Dynamiczne podejścia SERS zwiększyły czułość w kontekście kropli osiadłej (sessile-drop), umożliwiając wykrywanie parakwatu, tiabendazolu, triklyklazolu i izokarbofosu na poziomie ppm i ppb. Podejście to wykorzystuje metastabilny stan nanocząstek podczas odparowywania w celu utrzymania zdolności rozróżniania w wzbogaconych ekstraktach roślinnych. Liniowe zależności między charakterystycznymi intensywnościami pików a poziomami stężenia dodatkowo walidują tę metodę [18].
4.3 Profilowanie mikotoksyn i markerów mikrobiologicznych
Standardy regulacyjne nakładają obowiązek badania mikotoksyn i jakości mikrobiologicznej substancji ziołowych, koncentrując się szczególnie na aflatoksynach i ochratoksynie A [13, 24]. Na przykład monografie USP określają maksymalny limit nie większy niż (NMT) 5 ppb dla aflatoksyny B1 i NMT 20 ppb dla sumy aflatoksyn B1, B2, G1 i G2 [19]. Limity te definiują czułość, jaką muszą osiągnąć metody skriningowe i potwierdzające.
Ze względu na główny nacisk na wykrywanie pestycydów i zastosowania w wykrywaniu zafałszowań metodą Raman/SERS, technologia ta jest najlepiej pozycjonowana jako uzupełniające narzędzie skriningowe w ramach szerszej strategii kontroli zanieczyszczeń. Jest to zgodne z wytycznymi regulacyjnymi sugerującymi, aby kontrola jakości była wspierana przez testy chemiczne, takie jak spektroskopia lub chromatografia, przy jednoczesnym wdrażaniu nowych technologii [1, 13].
4.4 Wnioskowanie o metalach ciężkich i zanieczyszczeniach nieorganicznych
EMA wymaga badania na obecność metali ciężkich i innych zanieczyszczeń pierwiastkowych w ziołowych produktach leczniczych, chyba że jest to inaczej uzasadnione, formułując oczekiwanie regulacyjne dotyczące profilowania śladowych zanieczyszczeń w botanicznych APIs [13, 24].
W obecnej bazie dowodowej Raman/SERS, zanieczyszczenia te są adresowane pośrednio poprzez lepszą kontrolę tożsamości surowców, szybszy skrining zafałszowań i priorytetyzację badań potwierdzających dla próbek o wysokim ryzyku. Niemniej jednak, metody ramanowskie nie są obecnie pozycjonowane jako samodzielne metody oznaczania ilościowego zanieczyszczeń pierwiastkowych bez dodatkowej walidacji lub technologii komplementarnych [1, 13, 21].
4.5 In-Line i On-Line Raman PAT w przetwórstwie botanicznym
Ramy technologii analitycznej procesu (PAT) wykorzystują analizę w czasie rzeczywistym do optymalizacji jakości produktu i kontroli procesu. Spektroskopia Ramana jest opisywana jako dobrze nadająca się do tego celu, oferując szybką, nieinwazyjną analizę zgodną z warunkami produkcji w toku [3].
Jednym z przykładów Raman-PAT jest zastosowanie modelu RS-CARS-PLS do monitorowania procesów ekstrakcji w produkcji granulek Wenxin. Chociaż model wykazał skuteczne monitorowanie procesu, jego czułość dla analitów o niskim stężeniu, takich jak sacharydy, była ograniczona — co podkreśla potrzebę stosowania SERS lub technik uzupełniających do wykrywania zanieczyszczeń na poziomie śladowym [3].
Wdrożenie przemysłowe stwarza dodatkowe wyzwania, ponieważ większość badań PAT odbywa się w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych. Wytrzymałość i kontrola zmienności muszą zostać uwzględnione w celu udanego skalowania i wdrożenia na żywo [3].
4.6 Porównawcza wydajność analityczna
Konwencjonalna spektroskopia Ramana zapewnia szybkie, nieniszczące chemiczne fingerprinty bez konieczności wstępnej obróbki próbki. W przeciwieństwie do niej, SERS zwiększa czułość w celu wykrywania zanieczyszczeń na poziomie śladowym, osiągając granice wykrywalności od 1 ppm do poziomu tak niskiego jak 0.001 ppm dla niektórych pestycydów, w zależności od metody i matrycy [4, 5, 6, 7]. Na przykład, SERS w połączeniu z kalibracją wykazał wykrywanie pestycydów w warzywach liściastych ze współczynnikami korelacji do 0.98291 i zakończeniem całego procesu w zaledwie pięć minut [16].
W zastosowaniach autentykacji, PCA okazało się przydatne w różnicowaniu subtelnych zmian spektralnych w olejkach eterycznych, a techniki ramanowskie oparte na kodach kreskowych wykazały 100% dokładność w identyfikacji sfałszowanych i autentycznych produktów gotowych [9–11].
4.7 Przenośna i ręczna aparatura do skriningu surowców
Przenośne instrumenty Ramana są pozycjonowane jako efektywne czasowo, nieniszczące narzędzia zdolne do szybkiej analizy materiałów ziołowych bez potrzeby złożonego przygotowania. Mają one również zastosowanie w monitorowaniu zgodności produktów ziołowych z przepisami bezpieczeństwa i higieny pracy, oferując cenne narzędzie do skriningu zarówno w zakładzie, jak i po wprowadzeniu do obrotu [12].
Wytyczne regulacyjne FDA wskazują na pojawiające się metody, takie jak spektroskopia Ramana sterowana morfologią (MDRS), jako przydatne w zadaniach takich jak charakterystyka rozkładu wielkości cząstek, gdy są poparte rygorystyczną walidacją. Choć nie są one specyficzne dla botanicznych APIs, metody te wykazują zdolność spektroskopii Ramana do uzupełniania tradycyjnych technik analitycznych [25, 26].
Dyskusja
Zsyntetyzowane dowody potwierdzają, że Raman i SERS są wartościowymi narzędziami do nieniszczącego, szybkiego skriningu i monitorowania w czasie rzeczywistym w środowiskach PAT. Technologie te mogą być skutecznie integrowane z procesami kontroli zanieczyszczeń i zapewnienia jakości botanicznych APIs [2, 3, 5].
5.1 Zalety Raman i PAT w porównaniu do klasycznych metod niszczących
Spektroskopia Ramana jest korzystna ze względu na swoją szybkość, właściwości nieniszczące i minimalne wymagania dotyczące przygotowania próbki. SERS rozszerza tę użyteczność, umożliwiając wykrywanie na poziomie śladowym dzięki mechanizmom wzmocnienia, co wykazano w detekcji pestycydów do poziomu ppb przy szybkim całkowitym czasie procesu, czyniąc tę metodę idealną do wstępnego skriningu i selekcji próbek do badań potwierdzających [2, 4, 5, 16].
5.2 Ograniczenia
Kluczowe ograniczenia obejmują wyzwania związane z czułością w podstawowych metodach Ramana, szczególnie w przypadku analitów o niskim stężeniu bez wzmocnienia SERS. Przemysłowe wykorzystanie PAT opartego na metodzie Ramana wymaga również pokonania wyzwań związanych ze zmiennością i solidnym skalowaniem. Dodatkowo, poleganie na modelach chemometrycznych, takich jak PCA i PLS, wprowadza złożoność i potencjalną niepewność zależną od zmienności matrycy i uczenia modelu [3, 9, 22, 23].
Wytyczne regulacyjne i narzędzia skriningowe oparte na metodzie Ramana
Wytyczne regulacyjne wspierają podejście do jakości produktów botanicznych oparte na całości dowodów, w tym kontrolę botanicznego surowca i badania kontroli jakości chemicznej z wykorzystaniem metod spektroskopowych i/lub chromatograficznych. Zapewnia to koncepcyjną ścieżkę dla narzędzi skriningowych opartych na metodzie Ramana do integracji z ogólnymi strategiami kontroli, zamiast traktowania ich jako samodzielne zamienniki wszystkich klasycznych oznaczeń. [1]
Wytyczne FDA wyraźnie wzywają do przeprowadzania testów na pozostałości pestycydów i toksyn przypadkowych, takich jak aflatoksyny, a także na obecność materiałów obcych i substancji zafałszowujących. Jest to zgodne z możliwościami Raman/SERS w zakresie skriningu pestycydów i wykrywania zafałszowań, wzmacniając potrzebę objęcia klas zanieczyszczeń kompleksowym programem kontroli. [1]
FDA stwierdza również, że wnioskodawcy powinni oceniać obecne i pojawiające się technologie oraz opracowywać ortogonalne metody analityczne w celu zapewnienia odpowiedniej identyfikacji i ilościowego określenia. Można to interpretować jako wsparcie dla wdrożenia Raman/SERS jako części zestawu metod ortogonalnych połączonych z metodami potwierdzającymi, takimi jak LC–MS lub inne oznaczenia do definitywnego oznaczenia ilościowego, zwłaszcza tam, gdzie wydajność SERS zależy od kontroli przygotowania próbki dla dokładnej oznaczalności ilościowej względem LC–MS. [1, 27] Wspierając ten pogląd, badanie porównujące SERS i LC–MS dla nieoczekiwanego herbicydu w skomplikowanej matrycy wykazało, że SERS cechował się wysoką czułością i wyższą wydajnością wykrywania celów ultra-śladowych, podczas gdy LC–MS zapewniał dokładniejszą oznaczalność ilościową ułatwioną przez dobrze kontrolowane przygotowanie próbki. Motywuje to do stosowania architektury wielopoziomowej: SERS do szybkiej czułej detekcji i LC–MS do potwierdzającego oznaczenia ilościowego. [27]
W UE wytyczne EMA dotyczące specyfikacji definiują specyfikacje i identyfikują grupy zanieczyszczeń, które powinny być monitorowane (w tym metale ciężkie, pozostałości pestycydów, mikotoksyny, zanieczyszczenia mikrobiologiczne). Zezwalają one na okresowe badania wyrywkowe (skip testing), jeśli jest to uzasadnione oceną ryzyka i danymi z serii, co sugeruje, że strumienie danych Raman/PAT mogłyby stanowić dowód wspierający dla strategii badań opartych na ryzyku, o ile zostaną walidowane i wykażą zdolność do terminowego wykrywania istotnych odchyleń. [13, 14]
5.4 Strategia wdrażania oparta na ryzyku i zarządzanie cyklem życia
Wytyczne USP wskazują, że zakres badań może być określony przy użyciu podejścia opartego na ryzyku, które uwzględnia prawdopodobieństwo zanieczyszczenia. Wspiera to strategię, w której intensywność skriningu Raman/SERS i badania potwierdzające są przydzielane na podstawie czynników ryzyka, takich jak źródło, geografia, historia serii i wcześniejsze dane ze skriningu. [19] EMA podobnie wskazuje, że okresowe badania wyrywkowe mogą być akceptowalne, gdy są uzasadnione, a uzasadnienie powinno uwzględniać materiał roślinny, warunki uprawy/produkcji, zanieczyszczenia z sąsiednich gospodarstw, pochodzenie geograficzne oraz być poparte oceną ryzyka i danymi serii, co wzmacnia potrzebę stosowania systemów monitorowania bogatych w dane, a nie doraźnych redukcji badań. [13]
W tym kontekście opartym na ryzyku, technologia PAT oparta na metodzie Ramana może być pozycjonowana jako generator szybkich, powtarzalnych fingerprintów i wyników skriningu, które wspierają monitorowanie trendów i szybką identyfikację nietypowych serii, podczas gdy oznaczenia potwierdzające są zarezerwowane dla serii oznaczonych przez skrining lub dla okresowej weryfikacji wydajności systemu skriningowego i stabilności kalibracji. [2, 13] Metoda identyfikacji API oparta na kodach kreskowych oraz ręczne wykrywanie zafałszowań olejków eterycznych ilustrują, jak solidne reguły decyzyjne (nakładanie się kodów kreskowych, intensywne pasma diagnostyczne) mogą uprościć decyzje skriningowe w niektórych kontekstach, podczas gdy dyskryminacja oparta na PCA wskazuje, gdzie wymagane są modele wielowymiarowe w celu utrzymania czułości na subtelne wzorce zafałszowań. [9, 11, 20]
Zarządzanie cyklem życia metod ramanowskich jest również sugerowane przez obserwacje FDA dotyczące zgłoszeń MDRS: brak danych walidacyjnych dotyczących powtarzalności i dokładności jest uchybieniem, co podkreśla, że metody PAT oparte na spektroskopii Ramana muszą być opracowywane z walidacją i dokumentacją wydajności jako centralnymi elementami interakcji regulacyjnych. [25]
5.5 Perspektywy
Dowody sugerują wiele kierunków technicznych zwiększających wykonalność PAT opartego na spektroskopii Ramana dla zanieczyszczeń śladowych. Po pierwsze, opisuje się jako wykonalne zwiększenie różnorodności technik (spektroskopia Ramana z transformacją Fouriera, rezonansowa spektroskopia Ramana, konfokalna spektroskopia Ramana i SERS) w celu wzmocnienia sygnałów ramanowskich oraz ewolucji instrumentów i przetwarzania próbek, co wspiera strategię wyboru wariantów techniki zgodnie z potrzebami matrycy i czułości, zamiast polegania na pojedynczej konfiguracji Ramana we wszystkich procesach botanicznych. [4]
Po drugie, selektywność SERS można zwiększyć poprzez funkcjonalizację nanostruktur cząsteczkami receptorowymi, takimi jak aptamery, co wskazuje ścieżkę w kierunku celowanych oznaczeń zanieczyszczeń śladowych osadzonych w modułach PAT, gdzie interferencja stanowi dominujące ryzyko. [5]
Po trzecie, podejścia SERS oparte na obrazowaniu są opisywane jako umożliwiające monitorowanie w czasie rzeczywistym i wykrywanie lokalizacji zanieczyszczeń na powierzchniach tkanek roślinnych lub w ich wnętrzu, co sugeruje, że przyszłe procesy pracy z botanicznymi APIs mogłyby obejmować mapowanie zanieczyszczeń z rozdzielczością przestrzenną dla materiałów wysokiego ryzyka lub do badania dróg zanieczyszczenia. [5] Wreszcie, praktyczny potencjał wdrożeniowy wspierają wnioski, że SERS mógłby być dalej implementowany w narzędziach do szybkiego wykrywania na miejscu dla bezpieczeństwa żywności i monitorowania środowiska, oraz dowody na to, że przenośne instrumenty Ramana mogą być używane do monitorowania zgodności produktów ziołowych z przepisami bezpieczeństwa na rynku konsumenckim, co podkreśla ciągłość od skriningu polowego po systemy PAT w produkcji. [12, 27]
6. Wnioski
Niniejsze badanie koncepcyjne oparte na syntezie dowodów wskazuje, że spektroskopia Ramana jest dobrze dopasowana do celów PAT, ponieważ jest szybka, nieniszcząca, nieinwazyjna i prosta w przygotowaniu próbek. Zastosowania ramanowskie są opisywane jako obejmujące zakres od laboratorium po linie produkcyjne, co wspiera spojrzenie na pomiary ramanowskie przez pryzmat cyklu życia — od skriningu przychodzącego surowca po monitorowanie w procesie. [2]
PAT jest wyraźnie zdefiniowana jako umożliwiająca analizę w czasie rzeczywistym i sterowanie ze sprzężeniem zwrotnym w celu zapewnienia kontrolowanych procesów produkcji i optymalnej jakości. Spektroskopia oscylacyjna jest opisywana jako umożliwiająca online, w czasie rzeczywistym, szybkie wykrywanie jakości wewnętrznej ziół podczas przetwarzania, co stanowi koncepcyjną podstawę do umieszczania czujników Ramana w produkcji botanicznej. [3]
W przypadku zanieczyszczeń śladowych, SERS dostarcza najsilniejszej bazy dowodowej pod względem czułości, przy czym wzmocnienie potencjalnie osiąga granice wykrywalności ultra-śladowej na metalach szlachetnych, a liczne badania pestycydów wykazują reżimy detekcji od ppm do ppb, a nawet niskie stężenia nanomolarne, przy zachowaniu parametrów ilościowych i szybkich przepływów pracy (np. 5 min całkowitego czasu testu; <15 min ekstrakcji). [5, 8, 16, 18] Chemometria jest niezbędna w wielu zadaniach autentykacji i oznaczania ilościowego, ponieważ inspekcja wizualna może być niewystarczająca do wykrycia zafałszowań, podczas gdy PCA i PLSR wykazały skuteczność w dyskryminacji i prognozowaniu ilościowym. [9, 10]
Głównymi ograniczeniami profilowania śladowych zanieczyszczeń w botanicznych APIs w czasie rzeczywistym są ograniczenia czułości w niewzmocnionych modelach procesowych Raman PAT (ilustrowane przez stosunkowo wysokie LODs w monitorowaniu ekstrakcji) oraz wyzwania związane z wytrzymałością/walidacją przy skalowaniu PAT z laboratorium do produkcji, wraz z niepewnością wynikającą z matrycy w niektórych przypadkach skriningu substancji zafałszowujących. [3, 22] W konsekwencji, najbardziej uzasadnioną operacyjnie rekomendacją wspieraną przez dowody jest wielopoziomowa architektura PAT:
- Przenośny Raman + chemometria do szybkiej autentykacji/skriningu zafałszowań.
- Celowane oznaczenia SERS dla pozostałości pestycydów wysokiego ryzyka.
- Potwierdzające metody ortogonalne tam, gdzie oznaczalność ilościowa i regulacyjne podejmowanie decyzji wymagają wyższej pewności, zgodnie z oczekiwaniami regulacyjnymi dotyczącymi metod ortogonalnych i opartym na ryzyku uzasadnieniem badań wyrywkowych. [1, 5, 12, 13, 27]
Finansowanie
Brak finansowania zewnętrznego. [1]
Konflikt interesów
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów. [1]
Oświadczenie o dostępności danych
Wszystkie dane wykorzystane w niniejszym badaniu koncepcyjnym pochodzą z cytowanych opublikowanych źródeł i dokumentów regulacyjnych zsyntetyzowanych w niniejszym opracowaniu. [1, 14]
Rysunek 1
Rysunek 1. Koncepcyjny przepływ pracy PAT w zarządzaniu ryzykiem zanieczyszczeń botanicznych APIs integrujący nieniszczącą metodę Ramana i SERS: skrining przychodzącego surowca botanicznego przy użyciu szybkiej, nieniszczącej identyfikacji ramanowskiej w punktach przyjęć/dokach; chemometryczna autentykacja/kontrola zafałszowań (np. dyskryminacja oparta na PCA; potwierdzenie tożsamości poprzez nakładanie się kodów kreskowych) w celu zapewnienia tożsamości; celowane moduły SERS do skriningu śladowych ilości pestycydów i szybkiego ilościowego przewidywania (czułość ppm-do-ppb przy krótkich czasach pomiaru); monitorowanie ramanowskie w procesie podczas operacji jednostkowych produkcji w ramach PAT jako analiza w czasie rzeczywistym i sterowanie ze sprzężeniem zwrotnym; oraz oparte na ryzyku decyzje o okresowej weryfikacji/badaniach wyrywkowych wspierane przez historię serii i formalne oceny ryzyka zgodne z wytycznymi EMA/USP. [2, 3, 6, 9, 11, 13, 16, 19]
Tabela 2
| Klasa zanieczyszczenia/zafałszowania | Konfiguracja Raman/SERS | Punkty integracji PAT |
|---|---|---|
| Metale ciężkie | Nieniszczący skrining Ramana | Skrining surowców |
| Pozostałości pestycydów | Celowane moduły SERS | Skrining śladowy |
| Mikotoksyny | Dyskryminacja chemometryczna | Kontrola autentyczności |
Tabela 3
| Punkt odniesienia regulacyjny/kompendialny | Zgodność z Raman-Based PAT |
|---|---|
| Wytyczne USP | Walidowany skrining, strategie badań opartych na ryzyku |
| Specyfikacje EMA | Zgodność z grupami zanieczyszczeń, uzasadnienie badań okresowych |
| Rekomendacje FDA | Wsparcie metod ortogonalnych, zarządzanie cyklem życia |
