非破坏性拉曼光谱与过程分析技术 (PAT) 在植物活性药物成分实时痕量污染物分析中的应用
摘要
背景
植物活性药物成分 (APIs) 和植物药物物质需要采用能够控制变异性并利用“证据总量”方法管理污染风险的质量策略，其中包括植物原材料控制以及光谱和/或色谱方法等化学检测。[1] 监管指南明确要求对农药残留和外源性毒素（如黄曲霉毒素）进行检测，并对异物和掺杂物进行控制，这促使了可在整个供应链和制造生命周期中部署的快速筛查方法的出现。[1]
目的
本概念验证及数据综合研究评估了如何将非破坏性拉曼光谱（包括 SERS 增强型变体）集成到过程分析技术 (PAT) 框架中，用于植物 APIs 中实时或近实时的痕量污染物分析，重点关注可行性、分析性能以及已发表证据支持的部署约束。[2, 3]
方法
我们综合了显示以下内容的证据：
- 拉曼光谱对化学结构的敏感性以及极简的样品制备需求；[2, 4]
- SERS 增强及代表性痕量农药演示（包括 ppm 至 sub-ppb 级别）；[5–8]
- 用于掺杂物鉴定和定量预测的化学计量学策略；[9–11]
- 符合 PAT 的过程监测示例以及工业转化的已知障碍。[3]
结果
在汇总的研究中，当视觉检查不足时，拉曼光谱和化学计量学可以区分掺假精油，PCA 为纯净样品和掺假样品提供了光谱分离。[9] 定量拉曼建模 (PLSR) 在浓度预测任务中实现了高水平的预测准确性，支持了在复杂制剂中进行基于校准的定量的合理性。[10]
对于痕量污染物，SERS 研究报告称，对于选定的农药，在水果表面的检测限低至 1 ppm；在其他工作中，使用胶体金纳米颗粒测得 21 种农药的 LODs 范围为 0.001–10 ppm。[6, 7] 配合 QuEChERS 乙酸盐提取的便携式 SERS 检测到印度香米中多种农药低于 EU MRL 10 ppb（针对选定分析物），提取在 15 min 内完成，展示了务实的“先筛查”工作流程。[8]
对于 PAT 应用，拉曼光谱的快速、非破坏性、非侵入性测量以及从实验室部署到生产线的能力支持了 inline/online 监测。然而，证据也强调，大多数 PAT 研究仍处于实验室规模，且拉曼过程模型可能具有相对较高的 LODs，在提取监测环境中可能会漏掉低浓度目标。[2, 3]
结论
证据支持用于植物 API 污染物风险管理的拉曼/SERS 赋能 PAT 概念的可行性：部署便携式拉曼光谱用于进料鉴定和掺杂物筛查；使用 SERS 模块进行定向农药筛查；并在工艺条件允许稳定校准转移和足够检测能力的情况下，将基于拉曼的多变量模型集成到 PAT 控制环路中。[3, 12]
主要局限性在于异质植物基质中超痕量目标的灵敏度、荧光和弱拉曼信号，以及监管机构接受减免或跳批测试方法所需的验证/模型转移要求。[3, 4, 13]
关键词
- Raman spectroscopy
- SERS
- Process analytical technology
- Botanical API
- Pesticide residues
- Adulterant detection
- Chemometrics
- Real-time monitoring
引言
植物药物物质和植物 APIs 受质量范式的监管，该范式强调由“证据总量”方法支持的治疗一致性，包括植物原材料控制和可能使用光谱和/或色谱方法的化学质量控制检测。[1] 在这一范式下，污染和掺假风险被明确列为需要检测策略的质量关注点，包括对残留农药（包括母体农药和主要毒性代谢物）和外源性毒素（如黄曲霉毒素）的检测，以及针对异物和掺杂物的控制。[1]
与此同时，欧洲关于草药物质和制剂的规格指南将规格定义为用于确保放行和货架期质量的检测、程序和验收标准，并确定了应视情况处理的污染物组，包括重金属/元素杂质、农药和熏蒸剂残留、真菌毒素（aflatoxins, ochratoxin A）以及微生物污染。[13, 14] EMA 指南还指出，在通过风险评估和批次数据证明合理的情况下，污染物残留的定期/跳批测试可能是可以接受的，这为更快速的筛查和过程理解工具建立了明确的监管激励，这些工具可以在不损害安全性的情况下证明基于风险的控制策略的合理性。[13]
拉曼光谱是此类策略的候选方案，因为拉曼散射提供具有化学特异性的“指纹”光谱，且拉曼方法通常被描述为快速、非破坏性和非侵入性，且样品制备简单，这些操作特性符合制造和供应链控制过程中的实时决策需求。[2, 4]
对制药拉曼应用的综述描述了其部署范围从实验室使用延伸到码头和生产线，这意味着拉曼光谱不仅可以被视为 off-line 鉴定工具，还可以作为 PAT 背景下潜在的在制过程分析传感器。[2] PAT 被明确定义为利用一系列工具和手段，在工业生产过程中实现实时分析和反馈控制，以确保生产过程可控和产品质量最佳，而振动光谱技术被描述为能够对加工过程中草药的内部质量属性进行 online、实时、快速的检测。[3]
然而，植物药中的痕量污染物分析在分析上具有挑战性，文献指出了主要的转化挑战：大多数 PAT 研究是在实验条件较易控制的实验室规模设备上进行的，且基于拉曼的过程模型可能具有相对较高的 LODs，在模拟提取监测任务中无法检测到低浓度目标。[3] 这些约束促使了一个针对植物 APIs 的设计导向型问题：如何将拉曼（和 SERS 增强拉曼）部署在 PAT 框架内，使其能够提供快速、非破坏性的筛查，并在可行的情况下提供对基质和过程变异具有鲁棒性的定量预测，同时保持与基于风险的污染物控制和方法验证的监管预期相兼容？[2, 3, 13]
因此，本文解决的研究问题是：已发表的拉曼和 SERS 性能证据能否支持一种实用的 PAT 架构，用于植物 APIs 中近实时的痕量污染物分析，从而补充或分流经典的确认性分析？[3, 6, 8] 工作假设是，基于拉曼的非破坏性指纹识别作为分级 PAT 系统将最为有效：(i) 拉曼光谱 + 化学计量学用于快速鉴定/掺假筛查；(ii) 定向 SERS 模块用于相关基质中的痕量农药检测；(iii) 在灵敏度足够的情况下，对内部质量属性进行过程拉曼监测，并根据数据和批次历史证明基于风险的跳批测试的合理性，而非仅依靠传感器部署。[3, 6, 9, 13]
定量预测与基于校准的推断
在定量预测和基于校准的推断方面，一项针对掺有 xylene 的 methyl eugenol 制剂的拉曼研究报告称，PCA 有助于区分不同浓度的拉曼光谱数据集。此外，PLSR 模型能够可靠地预测未知样品的浓度，证明了拉曼光谱与 PLSR 的结合可以实现较高的预测性能。这强调了在参考物质可用时，其在为植物 APIs 中已知风险掺杂物开发定量模型方面的潜在效用 [10]。
成品中的身份确认
一种基于条形码的拉曼方法已被证明在确认成品中 APIs 的身份方面是有效的。该技术的工作原理是比较预期的 API 和成品药物条形码之间非零重叠的百分比，其中光谱经过变换以突出拉曼峰 [11]。利用这种方法，18 种获批的成品药物和 9 种模拟假药被 100% 准确地识别。这支持了在制剂产品中使用基于拉曼的“指纹重叠”逻辑进行鲁棒身份验证的可行性，前提是应用了适当的变换和决策规则 [11]。
植物药“外观相似”风险的拉曼分析
拉曼光谱特征方法已被用于在植物药背景下区分真实样品和掺假样品。例如，对 Phansomba/Phellinus 样品的分析显示，真实标本与掺假标本之间存在明显分离。识别出了 Phellinus（尤其是 Ph. merrillii）特征性的关键拉曼能带（487, 528, 786, 892, 915, 和 1436 cm），这表明为其他草药的检查工作流程建立特征范围数据库具有潜力 [21]。
然而，局限性依然存在。在对 50 种声称具有壮阳功效的草本膳食补充剂进行筛查时，拉曼光谱检测到了 9 个掺假样品（4 个含有 sildenafil，5 个含有 tadalafil）。然而，它未能针对两个样品中的 tadalafil 掺假提供结论性结果，表明在某些情况下需要确认性方法或增强型光谱解释策略 [22]。
4.2 通过 SERS 检测农药残留
已发表的证据强调，SERS 是一种快速、非破坏性的技术，能够检测植物污染物控制标准要求的痕量水平（ppm 或 ppb）农药 [1, 6, 19]。一项研究证明了 SERS 在水果表面检测农药的能力，水平低至 1 ppm，这与 apples 的监管农药残留限量具有良好的相关性 [6]。
定量 SERS 研究显示了强大的校准性能。例如，一项研究报告了 omethoate 的决定系数 (R²) 为 0.99，chlorpyrifos 为 0.98，检测限 (LODs) 分别为 1.63 mg·cm 和 2.64 mg·cm。这强调了利用特征 SERS 峰强度进行残留量定量的校准模型的可行性 [17]。在这项研究中，分析物特异性拉曼峰（omethoate 为 413 cm，chlorpyrifos 为 346 cm）被用于通过校准模型进行浓度映射 [17]。
胶体金纳米颗粒 SERS 进一步增强了 21 种不同农药的拉曼散射。检测限范围为 0.001 至 10 ppm，并利用 PCA 和 SERS 在 apple 皮上实现了 phosmet 和 thiram 的同时识别 [7]。
对于叶菜基质，phosmet, thiabendazole, 和 acetamiprid 的农药残留校准曲线表现出极强的线性相关系数，回收率在 94.67% 至 112.89% 之间。基于回收率的验证报告的相对标准偏差在 3.87% 至 8.56% 之间。包括采样、光谱分析和定量预测在内的整个测试过程在五分钟内完成，比传统的色谱方法有了显著改进 [16]。
在植物基质背景下，SERS 展示了检测 Corydalis 中 deltamethrin 的潜力。主要特征峰确定在 999 cm，随着建模的增加，直接观察 999 cm 峰的检测限低至 0.186 mg/L。PLS 模型的使用也实现了良好的预测性能指标 [23]。
便携式 SERS 设备配合 QuEChERS 乙酸盐提取，证明了在 15 分钟内检测 basmati rice 中多种农药残留的能力。CBM, THI, 和 TRI 等农药的检测水平低于 EU 最大残留限量 (MRL) 10 ppb。然而，ACE 的检测限仍维持在 800 ppb，突显了多残留工作流程中分析物灵敏度的潜在差异 [8]。
动态 SERS 方法增强了静滴环境下的灵敏度，使 paraquat, thiabendazole, tricyclazole, 和 isocarbophos 的检测限达到 ppm 和 ppb 级别。该方法利用挥发过程中的亚稳态纳米颗粒状态，在添加了分析物的蔬菜提取物中保持可区分性。特征峰强度与浓度水平之间的线性关系进一步验证了该方法 [18]。
4.3 真菌毒素和微生物标记物分析
监管标准强制要求对草药物质进行真菌毒素和微生物质量检测，特别关注 aflatoxins 和 ochratoxin A [13, 24]。例如，USP 专题论文规定 aflatoxin B1 的最高限量为 NMT 5 ppb，aflatoxins B1, B2, G1, 和 G2 的总和为 NMT 20 ppb [19]。这些限量定义了筛查和确认方法必须达到的灵敏度。
由于主要重点是拉曼/SERS 在农药检测和掺假应用，该技术最适合作为更广泛污染物控制策略中的补充筛查工具。这符合监管指南，即质量控制应由光谱或色谱等化学测试支持，同时结合新兴技术 [1, 13]。
4.4 重金属和无机污染物推断
EMA 要求除非另有证明，否则必须对草药制剂中的重金属和其他元素杂质进行检测，这构成了对植物 APIs 痕量污染物分析的监管预期 [13, 24]。
在目前的拉曼/SERS 证据库中，这些污染物是通过改进原材料身份控制、更快的掺假筛查以及优先对高风险样品进行确认性测试来间接处理的。然而，在没有额外验证或补充技术的情况下，拉曼方法目前尚未被定位为元素杂质定量的独立方法 [1, 13, 21]。
4.5 植物药加工中的 In-Line 和 On-Line 拉曼 PAT
过程分析技术 (PAT) 框架利用实时分析来优化产品质量和过程控制。拉曼光谱被描述为非常适合此目的，提供与在制生产条件兼容的快速、非侵入性分析 [3]。
拉曼-PAT 的一个例子是使用 RS-CARS-PLS 模型监测稳心颗粒生产中的提取过程。虽然该模型展示了有效的过程监测，但它对低浓度分析物（如糖类）的灵敏度有限，这突显了需要 SERS 或补充技术来检测痕量水平的污染物 [3]。
工业部署带来了额外的挑战，因为大多数 PAT 研究发生在实验室受控环境中。为了成功实现规模化和现场实施，需要解决鲁棒性和变异性控制问题 [3]。
4.6 分析性能比较
常规拉曼光谱提供快速、非破坏性的化学指纹，无需样品预处理。相比之下，SERS 增强了灵敏度以检测痕量水平的污染物，根据方法和基质的不同，某些农药的检测限从 1 ppm 达到低至 0.001 ppm [4, 5, 6, 7]。例如，SERS 结合校准在叶菜中展示了农药检测，相关系数高达 0.98291，且整体工作流程在仅五分钟内完成 [16]。
对于鉴定应用，PCA 已被用于区分精油中细微的光谱变化，基于条形码的拉曼技术在识别假冒和真实成品方面显示出 100% 的准确率 [9–11]。
4.7 用于原材料筛查的便携式和手持式仪器
便携式拉曼仪器被定位为高效、非破坏性的工具，能够快速分析草药材料而无需复杂的准备。它们也适用于监测草药产品的健康和安全合规性，为工厂内和市场后筛查提供了宝贵的工具 [12]。
FDA 的监管指南强调了形态定向拉曼光谱 (MDRS) 等新兴方法在有严格验证支持的情况下，对于颗粒粒径分布表征等任务非常有用。虽然不是植物 API 特有的，但这些方法证明了拉曼光谱补充传统分析技术的能力 [25, 26]。
讨论
综合证据支持拉曼光谱和 SERS 作为 PAT 环境中非破坏性、快速筛查和实时监测的宝贵工具。这些技术可以有效地集成到植物 APIs 的污染物控制和质量保证工作流程中 [2, 3, 5]。
5.1 拉曼光谱和 PAT 相对于传统破坏性方法的优势
拉曼光谱的优势在于其速度、非破坏性以及极简的样品制备要求。SERS 扩展了这一效用，通过增强机制实现了痕量水平检测，已被证明能以快速的总工作流程时间检测低至 ppb 级别的农药，使其成为初步筛查和分流样品以进行确认性测试的理想选择 [2, 4, 5, 16]。
5.2 局限性
关键局限性包括基础拉曼方法的灵敏度挑战，特别是对于没有 SERS 增强的低浓度分析物。基于拉曼的 PAT 的工业化应用还需要克服变异性和鲁棒规模化的挑战。此外，对 PCA 和 PLS 等化学计量学模型的依赖引入了复杂性和潜在的不确定性，具体取决于基质变异和模型训练 [3, 9, 22, 23]。
监管指南与基于拉曼的筛查工具
监管指南支持基于证据总量的植物药质量方法，包括植物原材料控制和使用光谱和/或色谱方法的化学质量控制测试。这为基于拉曼的筛查工具集成到整体控制策略中提供了概念路径，而不是将其视为所有经典分析的独立替代品。[1]
FDA 指南明确要求检测残留农药和外源性毒素（如黄曲霉毒素），以及异物和掺杂物。这与拉曼/SERS 在农药筛查和掺杂物检测方面的能力相一致，加强了在综合控制计划中涵盖污染物类别的必要性。[1]
FDA 还指出，申请人应评估当前和新兴技术，并开发正交分析方法以提供充分的鉴定和定量。这可以解释为支持拉曼/SERS 作为正交方法集的一部分进行部署，并与 LC–MS 等确认性方法或其他用于最终定量的分析配对，特别是在 SERS 性能依赖样品预处理控制以获得相对于 LC–MS 的准确可定量性的情况下。[1, 27] 支持这一观点的一项针对复杂基质中意外除草剂的 SERS 和 LC–MS 对比研究报告称，SERS 对超痕量目标检测表现出高灵敏度和更高的检测效率，而 LC–MS 则借助于严格受控的样品预处理提供了更准确的可定量性。这促使了一种分级架构：SERS 用于快速灵敏检测，LC–MS 用于确认性定量。[27]
在欧盟，EMA 规格指南定义了规格并确定了应处理的污染物组（包括重金属、农药残留、真菌毒素、微生物污染）。在风险评估和批次数据证明合理的情况下，它允许定期/跳批测试，这意味着如果拉曼/PAT 数据流经过验证并显示能及时检测到相关偏差，它们可能为基于风险的检测策略提供支持性证据。[13, 14]
5.4 基于风险的部署策略与生命周期管理
USP 指南指出，测试范围可使用考虑污染可能性的基于风险的方法来确定。这支持了一项策略，即根据来源、地理、批次历史和先前的筛查数据等风险因素分配拉曼/SERS 筛查强度和确认性测试。[19] EMA 同样指出，在合理的情况下，定期/跳批测试可能是可以接受的，且论证应考虑植物材料、栽培/生产条件、邻近农场污染、地理来源，并由风险评估和批次数据支持，加强了对数据丰富型监测系统的需求，而非随机减少测试。[13]
在这种基于风险的背景下，基于拉曼的 PAT 可以定位为快速、可重复指纹和筛查结果的生成器，支持趋势监测和异常批次的快速识别，而确认性分析则保留给筛查标记的批次，或用于定期验证筛查系统的性能和校准稳定性。[2, 13] 基于条形码的 API 身份识别方法和便携式精油掺假检测说明了鲁棒的决策规则（条形码重叠、高强度诊断带）如何在某些情况下简化筛查决策，而基于 PCA 的判别则表明在何处需要多变量模型来保持对微妙掺假模式的敏感性。[9, 11, 20]
拉曼方法的生命周期管理也隐含在 FDA 对 MDRS 提交文件的观察中：缺乏关于重复性和准确性的验证数据是一个缺陷，强调了基于拉曼的 PAT 方法必须以验证和性能文档作为监管互动的核心交付物进行开发。[25]
5.5 展望
证据表明，有多个技术方向可提高基于拉曼的 PAT 在痕量污染物方面的可行性。首先，增加技术多样性（傅里叶变换拉曼、共振拉曼、共聚焦拉曼和 SERS）被描述为增强拉曼信号以及演进仪器和样品处理的可行方案，支持根据基质和灵敏度需求选择技术变体，而不是在所有植物药工艺中依赖单一拉曼配置。[4]
其次，通过使用适配体等受体分子对纳米结构进行功能化，可以增强 SERS 的选择性，这为在干扰为主要风险的 PAT 模块中嵌入定向痕量污染物分析指明了道路。[5]
第三，基于成像的 SERS 方法被描述为允许对植物组织表面或内部的污染定位进行实时监测和检测，表明未来的植物 API 工作流程可能会包含针对高风险材料的空间分辨率污染映射，或用于污染路径的调查。[5] 最后，实际部署潜力得到了以下结论的支持：SERS 可以进一步在食品安全和环境监测的快速现场检测工具中实施；且有证据表明便携式拉曼仪器可用于监测消费市场中草药产品的健康和安全合规性，突显了从现场筛查到制造 PAT 系统的连续性。[12, 27]
6. 结论
本概念性证据综合研究表明，拉曼光谱与 PAT 目标高度一致，因为它具有快速、非破坏性、非侵入性且样品制备简单的特点。拉曼应用被描述为跨越实验室到生产线，支持了从进料原材料筛查到过程监测的基于拉曼测量的生命周期视角。[2]
PAT 被明确定义为能够实现实时分析和反馈控制，以确保可控的生产过程和最佳质量。振动光谱被描述为能够在线实时快速检测加工过程中草药的内部质量，为植物药制造中拉曼传感器的安置提供了概念基础。[3]
对于痕量污染物，SERS 为灵敏度提供了最强的证据基础，在贵金属上的增强作用可能达到超痕量检测限，且多项农药研究展示了具有定量指标和快速工作流程（例如，5 min 总测试时间；<15 min 提取）的 ppm 至 ppb 甚至低纳摩尔检测范围。[5, 8, 16, 18] 化学计量学对于许多真实性识别和定量任务至关重要，因为视觉检查可能不足以检测掺假，而 PCA 和 PLSR 已经展示了辨别和定量预测性能。[9, 10]
植物 APIs 实时痕量污染物分析的主要局限性在于非增强型拉曼 PAT 过程模型的灵敏度约束（表现为提取监测中相对较高的 LODs），以及将 PAT 从实验室推广到生产的鲁棒性/验证挑战，以及某些掺杂物筛查案例中基质驱动的不确定性。[3, 22] 因此，证据支持的最合理的运营建议是分层 PAT 架构：
- 便携式拉曼 + 化学计量学用于快速鉴定/掺假筛查。
- 针对高风险农药残留的定向 SERS 分析。
- 在可定量性和监管决策需要更高保证时，采用确认性正交方法，这符合对正交方法的监管预期以及对跳批测试的基于风险的论证。[1, 5, 12, 13, 27]
资助
无外部资助。[1]
利益冲突
作者声明不存在利益冲突。[1]
数据可用性声明
本概念研究中使用的所有数据均来自此处综合的引用已发表来源和监管文件。[1, 14]
图 1
图 1. 用于植物 API 污染物风险管理的集成非破坏性拉曼和 SERS 的概念性 PAT 工作流程：在接收/码头点使用快速非破坏性拉曼指纹识别进行进料植物原材料筛查；进行化学计量学鉴定/掺假检查（如基于 PCA 的辨别；条形码重叠身份确认）以确保身份；用于痕量农药筛查和快速定量预测的定向 SERS 模块（ppm 至 ppb 灵敏度，测量时间短）；在 PAT 框架下定义为实时分析和反馈控制的制造单元操作中的过程拉曼监测；以及由批次历史和符合 EMA/USP 指南的正式风险评估支持的基于风险的定期验证/跳批测试决策。[2, 3, 6, 9, 11, 13, 16, 19]
表 2
| 污染物/掺假类别 | 拉曼/SERS 配置 | PAT 集成点 |
|---|---|---|
| 重金属 | 非破坏性拉曼筛查 | 原材料筛查 |
| 农药残留 | 定向 SERS 模块 | 痕量筛查 |
| 真菌毒素 | 化学计量学辨别 | 鉴定检查 |
表 3
| 监管/药典依据 | 基于拉曼的 PAT 衔接 |
|---|---|
| USP 指南 | 经验证的筛查、基于风险的检测策略 |
| EMA 规格 | 符合污染物组要求、定期测试合理性 |
| FDA 建议 | 支持正交方法、生命周期管理 |
