用于基于 PAT 的植物源污染物检测的无损拉曼光谱技术

非破坏性拉曼光谱与过程分析技术 (PAT) 在植物活性药物成分实时痕量污染物剖析中的应用

摘要

背景

植物活性药物成分 (APIs) 和植物药物物质需要一套质量策略，能够通过“证据总和”方法来控制变异性并管理污染风险，其中包括植物原料控制和化学检测（如光谱法和/或色谱法）。[1] 法规指南明确要求对残留农药和外来毒素（如黄曲霉毒素）进行检测，并对异物和掺杂物进行控制，这促使了可在供应链和制造生命周期中部署的快速筛查方法的开发。[1]

目标

本概念性概念验证和数据综合研究评估了如何将非破坏性拉曼光谱（包括 SERS 增强变体）集成到过程分析技术 (PAT) 框架中，用于植物 APIs 中的实时或近实时痕量污染物剖析，重点关注基于已发表证据的可行性、分析性能和部署约束。[2, 3]

方法

我们综合了以下证据：

• 拉曼光谱对化学结构的敏感性以及极少的样品制备需求；[2, 4]
• SERS 增强和代表性痕量农药演示（包括 ppm 到 sub-ppb 级别）；[5–8]
• 用于掺杂物鉴定和定量预测的化学计量学策略；[9–11]
• 符合 PAT 要求的工艺监测示例以及工业转化的已知障碍。[3]

结果

在汇编的研究中，当目视检查不足时，拉曼光谱和化学计量学能够区分掺假的精油，PCA 为纯净样品和掺假样品提供了光谱分离。[9] 定量拉曼建模 (PLSR) 在浓度预测任务中实现了高水平的预测准确性，支持了在复杂配方中进行基于校准的定量的可能性。[10]

对于痕量污染物，SERS 研究报告称，选定农药在水果表面的检出限低至 1 ppm，在另一项工作中，使用胶体金纳米颗粒测量了 21 种农药的 LOD，范围涵盖 0.001–10 ppm。[6, 7] 采用 QuEChERS 乙酸盐萃取的便携式 SERS 能够在不到 15 min 内完成萃取，并检测出印度香米中多种低于 10 ppb 的 EU MRL 的农药，展示了务实的“筛查优先”工作流。[8]

对于 PAT 应用，拉曼光谱的快速、非破坏性、非侵入性测量能力以及从实验室部署到生产线的能力支持了线内/在线监测。然而，证据也强调，大多数 PAT 研究仍处于实验室规模，且拉曼过程模型可能具有相对较高的 LOD，在提取监测环境中会遗漏低浓度目标物。[2, 3]

结论

证据支持一种可行的基于拉曼/SERS 的 PAT 概念，用于植物 API 污染物风险管理：部署便携式拉曼光谱仪进行进料鉴定和掺杂物筛查；使用 SERS 模块进行针对性农药筛查；并将基于拉曼的多元模型集成到 PAT 控制环路中，前提是工艺条件允许稳定的校准转移和足够的检测能力。[3, 12]

主要局限性包括异质植物基质中超痕量目标的灵敏度、荧光和微弱的拉曼信号，以及法规接受减免检验或跳检方法所需的验证/模型转移要求。[3, 4, 13]

关键词

• 拉曼光谱
• SERS
• 过程分析技术
• 植物 API
• 农药残留
• 掺杂物检测
• 化学计量学
• 实时监测

引言

植物药物物质和植物 APIs 受质量范式的监管，这些范式强调通过“证据总和”方法支持治疗一致性，包括植物原料控制和可能使用光谱和/或色谱方法的化学质量控制检测。[1] 在此范式下，污染和掺假风险被明确列为需要检测策略的质量关注点，包括残留农药（包括母体农药和主要有毒代谢物）和外来毒素（如黄曲霉毒素）的检测，以及针对异物和掺杂物的控制。[1]

与此同时，欧洲关于草药物质和制剂的规格指南将规格定义为用于确保放行和货架期质量的检测、程序和验收标准，并确定了应视情况处理的污染物组，包括重金属/元素杂质、农药和熏蒸剂残留、真菌毒素（黄曲霉毒素、赭曲霉毒素 A）以及微生物污染。[13, 14] EMA 指南还指出，在通过风险评估和批次数据证明合理的情况下，污染物残留的定期/跳检可能是可以接受的，这为更快速的筛查和过程理解工具建立了明确的法规激励，这些工具可以在不损害安全性的情况下证明基于风险的控制策略的合理性。[13]

拉曼光谱是此类策略的候选技术，因为拉曼散射提供了具有化学特异性的“指纹”光谱，且拉曼方法通常被框架化为快速、非破坏性和非侵入性，且样品制备简单，这些操作特性与制造和供应链控制过程中的实时决策相一致。[2, 4]

对药物拉曼应用的综述描述了其部署范围，从实验室使用扩展到码头和生产线，这意味着拉曼光谱不仅可以被视为离线识别工具，还可以被视为 PAT 背景下的潜在过程分析传感器。[2] PAT 被明确定义为利用一系列工具和手段在工业生产过程中实现实时分析和反馈控制，以确保生产过程可控和产品质量最优，而振动光谱技术被描述为能够在线、实时、快速地检测药材加工过程中的内部质量属性。[3]

然而，植物药中的痕量污染物剖析在分析上具有挑战性，文献指出主要的转化挑战：大多数 PAT 研究是在实验条件易于控制的实验室规模设备上进行的，且基于拉曼的过程模型可能具有相对较高的 LOD，无法在模拟提取监测任务中检测到低浓度目标物。[3] 这些约束促使了植物 APIs 的一个设计导向型问题：如何在 PAT 框架内部署拉曼（及 SERS 增强拉曼），使其提供快速、非破坏性的筛查，并在可行的情况下提供对基质和过程变异具有鲁棒性的定量预测，同时保持与基于风险的污染物控制和方法验证的法规预期相兼容？ [2, 3, 13]

因此，本文解决的研究问题是：已发表的拉曼和 SERS 性能证据是否可以支持一种实用的 PAT 架构，用于植物 APIs 的近实时痕量污染物剖析，从而补充或分流经典的确认性分析？[3, 6, 8] 工作假设是，基于拉曼的非破坏性指纹识别作为分层 PAT 系统将最为有效：(i) 拉曼 + 化学计量学用于快速鉴定/掺假筛查；(ii) 针对性 SERS 模块用于相关基质中的痕量农药检测；(iii) 工艺拉曼监测用于灵敏度充足的内部质量属性，基于风险的跳检通过数据和批次历史而非仅通过传感器部署来证明合理性。[3, 6, 9, 13]

定量预测与基于校准的推断

在定量预测和基于校准的推断方面，一项针对掺有 xylene 的 methyl eugenol 配方的拉曼研究报告称，PCA 对于区分不同浓度的拉曼光谱数据集非常有用。此外，PLSR 模型能够可靠地预测未知样品的浓度，证明了拉曼光谱与 PLSR 的结合可以实现较高的预测性能。这强调了在参考物质可用时，该技术在开发植物 APIs 中已知风险掺杂物的定量模型方面的潜在效用 [10]。

成品身份确认

一种基于条形码的拉曼方法已被证明在确认成品中 APIs 的身份方面非常有效。该技术通过比较预期 API 与成品药物条形码之间非零重叠的百分比来工作，其中光谱经过转换以强调拉曼峰 [11]。利用这种方法，18 种获批的成品药物和 9 种模拟假药被以 100% 的准确率识别出来。这支持了使用基于拉曼的“指纹重叠”逻辑在制剂产品中进行稳健身份验证的可行性，前提是应用了适当的转换和决策规则 [11]。

植物“易混淆”风险的拉曼分析

拉曼光谱特征签名方法已被用于在植物背景下区分真实样本与掺假样本。例如，对 Phansomba/Phellinus 样本的分析显示真实标本与掺假标本之间存在明显的区分。识别出了 Phellinus（尤其是 Ph. merrillii）特征性的关键拉曼能带（487, 528, 786, 892, 915, 和 1436 cm），这表明为其他草药的检查流程建立签名范围数据库具有潜力 [21]。

然而，局限性依然存在。在对 50 种声称具有壮阳功能的草药膳食补充剂的筛查中，拉曼光谱检测到了 9 个掺假样本（4 个含有 sildenafil，5 个含有 tadalafil）。然而，它未能针对 2 个样本中的 tadalafil 掺假提供结论性结果，表明在某些情况下需要确认性方法或增强型光谱解释策略 [22]。

4.2 SERS 检测农药残留

已发表的证据强调，SERS 是一种快速、非破坏性的技术，能够检测出符合植物污染物控制标准的痕量级农药（ppm 或 ppb）[1, 6, 19]。一项研究证明了 SERS 在水果表面检测农药的能力，其水平低至 1 ppm，与苹果的法规农药残留限制具有良好的相关性 [6]。

定量 SERS 研究显示了强大的校准性能。例如，一项研究报告称 omethoate 的决定系数 (R²) 为 0.99，chlorpyrifos 为 0.98，检出限 (LODs) 分别为 1.63 mg·cm 和 2.64 mg·cm。这强调了利用特征 SERS 峰强度建立残留定量校准模型的可行性 [17]。在这项研究中，分析物特异性拉曼峰（omethoate 为 413 cm，chlorpyrifos 为 346 cm）被用于通过校准模型进行浓度映射 [17]。

胶体金纳米颗粒 SERS 进一步增强了 21 种不同农药的拉曼散射。检测限范围从 0.001 到 10 ppm，利用 PCA 和 SERS 在苹果皮上实现了 phosmet 和 thiram 的同时识别 [7]。

对于叶菜基质，phosmet、thiabendazole 和 acetamiprid 农药残留的校准曲线表现出强线性相关系数，回收率在 94.67% 到 112.89% 之间。基于回收率的验证报告的相对标准偏差在 3.87% 到 8.56% 之间。整个测试过程（包括采样、光谱分析和定量预测）在不到 5 分钟内完成，较传统色谱方法有显著改进 [16]。

在植物基质背景下，SERS 展示了检测元胡 (Corydalis) 中 deltamethrin 的潜力。主要的特征峰确定在 999 cm，随着建模的增加，直接观察 999 cm 峰的检测限低至 0.186 mg/L。PLS 模型的使用也实现了良好的预测性能指标 [23]。

便携式 SERS 设备结合 QuEChERS 乙酸盐萃取，证明了在 15 分钟内检测印度香米中多种农药残留的能力。CBM、THI 和 TRI 等农药的检测水平低于 EU 最大残留限量 (MRL) 10 ppb。然而，ACE 的检测限仍维持在 800 ppb，突显了多残留工作流程中分析物灵敏度的潜在差异 [8]。

动态 SERS 方法增强了静止液滴环境下的灵敏度，允许检测低至 ppm 和 ppb 水平的 paraquat、thiabendazole、tricyclazole 和 isocarbophos。该方法利用挥发过程中的亚稳态纳米颗粒状态，在添加了目标物的蔬菜提取物中保持可区分性。特征峰强度与浓度水平之间的线性关系进一步验证了该方法 [18]。

4.3 真菌毒素与微生物标记剖析

法规标准强制要求对草药物质进行真菌毒素和微生物质量检测，特别关注黄曲霉毒素和赭曲霉毒素 A [13, 24]。例如，USP 单行本规定黄曲霉毒素 B1 的最大限量为 NMT 5 ppb，黄曲霉毒素 B1、B2、G1 和 G2 的总和为 NMT 20 ppb [19]。这些限值定义了筛查和确认方法必须达到的灵敏度。

由于主要重点是拉曼/SERS 农药检测和掺假应用，该技术最适合作为更广泛污染物控制策略中的补充筛查工具。这符合法规指南，即质量控制应由光谱或色谱等化学测试支持，同时整合新兴技术 [1, 13]。

4.4 重金属与无机污染物推断

EMA 要求对草药产品中的重金属和其他元素杂质进行检测（除非另有说明），这构成了对植物 APIs 痕量污染物剖析的法规预期 [13, 24]。

在目前的拉曼/SERS 证据库中，这些污染物通过改进原料身份控制、更快的掺假筛查以及高风险样本的优先确认测试得到间接解决。然而，拉曼方法目前并未被定位为元素杂质定量的独立方法，除非经过额外验证或有补充技术支持 [1, 13, 21]。

4.5 用于植物加工的线内和在线拉曼 PAT

过程分析技术 (PAT) 框架利用实时分析来优化产品质量和过程控制。拉曼光谱被描述为非常适合此目的，它提供与生产过程制造条件兼容的快速、非侵入性分析 [3]。

拉曼-PAT 的一个例子是使用 RS-CARS-PLS 模型监测文心颗粒生产中的提取过程。虽然该模型展示了有效的过程监测，但其对低浓度分析物（如糖类）的灵敏度有限——这突显了需要 SERS 或补充技术来检测痕量级污染物 [3]。

工业部署提出了额外的挑战，因为大多数 PAT 研究发生在实验室受控环境中。为了成功实现规模化和实时实施，需要解决鲁棒性和变异性控制问题 [3]。

4.6 分析性能比较

常规拉曼光谱提供快速、非破坏性的化学指纹，无需样品预处理。相比之下，SERS 提高了检测痕量级污染物的灵敏度，根据方法和基质的不同，某些农药的检测限从 1 ppm 到低至 0.001 ppm [4, 5, 6, 7]。例如，SERS 结合校准在叶菜中展示了农药检测，相关系数高达 0.98291，整体工作流仅需 5 分钟即可完成 [16]。

对于鉴定应用，PCA 已被证明在区分精油中细微的光谱变化方面非常有用，且基于条形码的拉曼技术在识别伪造和真实成品方面显示出 100% 的准确率 [9–11]。

4.7 用于原料筛查的便携式和手持式仪器

便携式拉曼仪器被定位为高效、非破坏性的工具，能够快速分析草药材料而无需复杂的准备工作。它们也适用于监测草药产品的健康和安全合规性，为工厂内和上市后筛查提供了宝贵的工具 [12]。

来自 FDA 的法规指南强调，如果拥有严谨验证的支持，形貌定向拉曼光谱 (MDRS) 等新兴方法可用于粒径分布表征等任务。虽然并非专门针对植物 API，但这些方法证明了拉曼光谱补充传统分析技术的能力 [25, 26]。

讨论

综合证据支持拉曼光谱和 SERS 作为 PAT 环境中非破坏性、快速筛查和实时监测的宝贵工具。这些技术可以有效地集成到植物 APIs 的污染物控制和质量保证工作流中 [2, 3, 5]。

5.1 拉曼和 PAT 相对于传统破坏性方法的优势

拉曼光谱的优势在于其速度、非破坏性以及极少的样品制备要求。SERS 扩展了这一效用，通过增强机制实现了痕量级检测，已证明能检测出 ppb 级别的农药，且整体工作流时间短，使其成为确认性测试样本初步筛查和分流的理想选择 [2, 4, 5, 16]。

5.2 局限性

关键局限性包括基础拉曼光谱的灵敏度挑战，特别是对于没有 SERS 增强的低浓度分析物。基于拉曼的 PAT 的工业应用还需要克服变异性和稳健规模化的挑战。此外，对 PCA 和 PLS 等化学计量学模型的依赖引入了复杂性和潜在的不确定性，具体取决于基质变异性和模型训练 [3, 9, 22, 23]。

法规指南与基于拉曼的筛查工具

法规指南支持基于证据总和的植物药质量方法，包括植物原料控制和使用光谱法和/或色谱法的化学质量控制测试。这为基于拉曼的筛查工具集成到整体控制策略中提供了概念路径，而不是将其视为所有经典分析的独立替代方案。[1]

FDA 指南明确要求对残留农药和外来毒素（如黄曲霉毒素）以及异物和掺杂物进行检测。这与拉曼/SERS 在农药筛查和掺杂物检测方面的能力相一致，加强了在综合控制计划中覆盖污染物类别的必要性。[1]

FDA 还指出，申请人应评估当前和新兴技术，并开发正交分析方法以提供充足的鉴定和定量。这可以被解释为支持将拉曼/SERS 作为与确认性方法（如 LC–MS 或其他用于定性定量的分析）配对的正交方法集的一部分进行部署，特别是在 SERS 性能依赖样品预处理控制以实现相对于 LC–MS 的准确定量能力的情况下。[1, 27] 支持这一观点的一项研究比较了 SERS 和 LC–MS 对复杂基质中一种意外除草剂的检测，结果显示 SERS 对超痕量目标检测表现出高灵敏度和更高的检测效率，而 LC–MS 则借助于控制良好的样品预处理提供了更准确的定量。这促使了一种分层架构：SERS 用于快速灵敏检测，LC–MS 用于确认性定量。[27]

在欧盟，EMA 规格指南定义了规格并确定了应处理的污染物组（包括重金属、农药残留、真菌毒素、微生物污染）。它允许在风险评估和批次数据证明合理的情况下进行定期/跳检，这意味着如果拉曼/PAT 数据流经过验证并显示能及时检测到相关偏差，则可以为基于风险的检测策略提供支持性证据。[13, 14]

5.4 基于风险的部署策略与生命周期管理

USP 指南指出，检测范围可使用考虑污染可能性的风险评估方法来确定。这支持了一项策略，即根据来源、地理、批次历史和先前的筛查数据等风险因素来分配拉曼/SERS 筛查强度和确认性测试。[19] EMA 同样指出，在合理的情况下定期/跳检可能是可以接受的，证明应考虑植物材料、栽培/生产条件、邻近农场污染、地理来源，并得到风险评估和批次数据的支持，这加强了对数据丰富型监测系统的需求，而不是随意减少检测。[13]

在这种基于风险的背景下，基于拉曼的 PAT 可以被定位为快速、可重复指纹和筛查结果的产生者，支持趋势监测和异常批次的快速识别，而确认性分析则保留给筛查标记出的批次或用于筛查系统性能和校准稳定性的定期核查。[2, 13] 基于条形码的 API 身份方法和手持式精油掺假检测说明了稳健的决策规则（条形码重叠、强烈诊断带）如何在某些情况下简化筛查决策，而基于 PCA 的判别则表明了在哪些地方需要多元模型来保持对细微掺假模式的灵敏度。[9, 11, 20]

FDA 对 MDRS 申报资料的观察也隐含了拉曼方法的生命周期管理：缺乏关于重复性和准确性的验证数据是一项缺陷，这强调了基于拉曼的 PAT 方法在开发时必须将验证和性能文档作为法规沟通的核心交付物。[25]

5.5 展望

证据表明，提高基于拉曼的 PAT 用于痕量污染物的可行性有多个技术方向。首先，增加技术多样性（傅里叶变换拉曼、共振拉曼、共聚焦拉曼和 SERS）被描述为增强拉曼信号、演进仪器和样品处理的可行方案，支持根据基质和灵敏度需求选择技术变体，而不是在所有植物加工过程中依赖单一的拉曼配置。[4]

其次，SERS 的选择性可以通过使用受体分子（如适配体）对纳米结构进行功能化来增强，这指明了在干扰为主要风险的 PAT 模块中嵌入针对性痕量污染物分析的路径。[5]

第三，基于成像的 SERS 方法被描述为允许实时监测和检测植物组织表面或内部的污染定位，表明未来的植物 API 工作流可以整合针对高风险材料的或用于污染路径调查的空间分辨污染映射。[5] 最后，SERS 可以进一步在用于食品安全和环境监测的快速现场检测工具中实施，以及便携式拉曼仪器可用于监测消费市场中草药产品的健康和安全合规性，这些结论支持了实际部署潜力，强调了从现场筛查到制造 PAT 系统的连续性。[12, 27]

6. 结论

这项概念性的证据综合研究表明，拉曼光谱与 PAT 目标高度一致，因为它快速、非破坏性、非侵入性且样品制备简单。拉曼应用被描述为涵盖了从实验室到生产线，支持了基于拉曼的测量从进料原料筛查到过程监测的生命周期观点。[2]

PAT 被明确定义为能够实现实时分析和反馈控制，以确保可控的生产过程和最优的质量。振动光谱被描述为能够在线、实时、快速地检测加工过程中的药材内部质量，为植物药制造中的拉曼传感器放置提供了概念基础。[3]

对于痕量污染物，SERS 为灵敏度提供了最强的证据基础，在贵金属上的增强潜力可达到超痕量检测限，多项农药研究展示了 ppm 到 ppb 甚至低纳摩尔级的检测范围，并具有定量指标和快速工作流（例如，5 min 总测试时间；<15 min 萃取）。[5, 8, 16, 18] 化学计量学对于许多真实性鉴定和定量任务至关重要，因为目视检查不足以进行掺假检测，而 PCA 和 PLSR 已证明具有判别和定量预测性能。[9, 10]

植物 APIs 实时痕量污染物剖析的主要局限性是非增强拉曼 PAT 过程模型的灵敏度限制（表现为提取监测中相对较高的 LOD）以及 PAT 从实验室扩展到生产的鲁棒性/验证挑战，以及某些掺假筛查案例中基质驱动的不确定性。[3, 22] 因此，证据支持的最合理的运营建议是分层 PAT 架构：

1. 便携式拉曼 + 化学计量学用于快速鉴定/掺假筛查。
2. 针对高风险农药残留的针对性 SERS 分析。
3. 在定量能力和法规决策需要更高保证的情况下，采用确认性正交方法，这与法规对正交方法的预期以及基于风险的跳检合理性说明相一致。[1, 5, 12, 13, 27]

资助

无外部资助。[1]

利益冲突

作者声明不存在利益冲突。[1]

数据可用性声明

本概念性研究中使用的所有数据均来自本文综合引用的已发表来源和法规文件。[1, 14]

图 1

图 1. 用于植物 API 污染物风险管理的集成非破坏性拉曼和 SERS 的概念性 PAT 工作流：在接收/码头点使用快速、非破坏性拉曼指纹图谱进行进料植物原料筛查；进行化学计量学鉴定/掺假检查（如基于 PCA 的判别；条形码重叠身份确认）以确保身份真实；用于痕量农药筛查和快速定量预测的针对性 SERS 模块（具有短测量时间的 ppm 到 ppb 级灵敏度）；在 PAT 框架下作为实时分析和反馈控制进行的制造单元操作过程拉曼监测；以及由批次历史和符合 EMA/USP 指南的正式风险评估支持的基于风险的定期验证/跳检决策。[2, 3, 6, 9, 11, 13, 16, 19]

表 2

表 3