Overcoming the BCS Class IV Paradox in Senolytics: Nano-Micellar Delivery of Hydrophobic Flavonoids for Targeted Cellular Senescence Clearance
Executive summary
В представленной литературе fisetin и quercetin неоднократно упоминаются как биоактивные флавоноиды, эффективность которых в реальных условиях ограничена экспозицией, обусловленной особенностями рецептуры; при этом во многих источниках прямо указывается на плохую водную растворимость и низкую измеряемую биодоступность традиционных препаратов или растворов/суспензий.[1–4] Различные подходы на основе нано- и липидных систем (липосомы, нанолипосомы, полимерные мицеллы, наносуспензии, наноэмульсии, нанокохлеаты, SNEDDS) представлены как практические стратегии для улучшения системной экспозиции и/или кинетики абсорбции, что часто приводит к значительному количественному увеличению AUC или относительной биодоступности.[3–9] Наиболее выраженным фармакокинетическим сигналом у человека в данном наборе данных является гибридная система fisetin «мицеллы в гидрогеле» (FF-20), которая увеличила AUC0–12h для fisetin в 26.9 раза, а Cmax — с 9.97 ng/mL до 238.2 ng/mL по сравнению с препаратом сравнения без специальной формулы, одновременно расширив временное окно, в течение которого fisetin поддавался количественному определению в плазме.[4]
Senolytic rationale
В данном наборе данных fisetin в нескольких источниках прямо позиционируется как сенотерапевтический или сенолитический флавоноид, включая исследование, в котором fisetin был выбран именно как «хорошо изученный сенотерапевтический препарат» для тестирования в липосомах, и обзорное утверждение о том, что fisetin обладает «сенолитическими эффектами».[10, 11] Доклинические доказательства in vivo, упомянутые в представленных выдержках, указывают на то, что среди десяти натуральных флавоноидов, протестированных in vivo, fisetin был признан «наиболее мощным сенолитическим соединением», снижающим маркеры старения у прогероидных и старых мышей.[12] Однако единственный включенный в набор данных прямой эксперимент на модели старения (doxorubicin-индуцированное старение в клетках A549 и WI38) не выявил селективного сенолиза для свободного fisetin или липосом, нагруженных fisetin, в тестах на жизнеспособность, хотя при этом наблюдалась сеноморфная модуляция SASP цитокинов IL-6 и IL-8 методом ELISA.[10]
Liposomal encapsulation strategies
Липосомальный fisetin представлен несколькими подходами к приготовлению и характеристике, включая метод тонкого слоя / тонкой пленки с использованием определенных фосфолипидов и cholesterol, а также платформу нанолипосом на основе тонкопленочного испарения с опциональным покрытием hyaluronic acid для обеспечения стабильности и результатов мицелляризации в фазе пищеварения.[10, 13] В одном исследовании старения in vitro липосомы готовили путем смешивания DOPC, DSPE и cholesterol в органическом растворителе с образованием липидной пленки, последующей регидратацией в буфере HEPES и экструзией через поликарбонатные мембраны до 100 nm для получения однородных липосом.[10] Эти липосомы демонстрировали Z-average 115.9 ± 0.9 nm (PDI 0.155 ± 0.004) и ζ-potential −20.3 ± 0.6 mV в пустом виде, в то время как инкапсуляция fisetin уменьшила размер до 95.1 ± 1.0 nm (PDI 0.178 ± 0.008) и сместила ζ-potential до −11.6 ± 1.2 mV при эффективности инкапсуляции 13.68%.[10]
В отдельной системе нанолипосом использовались lecithin и fisetin в массовом соотношении 25:1 с концентрацией fisetin 0.8 mg/mL, полученные методом тонкопленочного испарения и ультразвуковой обработки (2 min при 40 W/cm²), что позволило получить прямоугольные нанолипосомы размером ~80 nm с PDI около 0.3.[13] Покрытие из hyaluronic acid (HA) наносилось путем растворения HA в фосфатном буфере и смешивания с нанолипосомами в объемном соотношении 1:10 при перемешивании в течение ночи; при этом молекулярная масса HA влияла на эффективность инкапсуляции (90–95% при 3/35/90–100 kDa, снижаясь до 79% при 150–250 kDa и до 74% при 1000–1500 kDa).[13]
Polymeric and self assembled micelles
Полимерные мицеллы прямо описываются в наборе данных как наноразмерные структуры типа ядро/оболочка, образованные амфифильными блок-сополимерами, причем несколько мицеллярных систем quercetin обеспечивают количественное улучшение пероральной PK. [2, 5, 7] У крыс мицеллы MPEG-b-PLLA с quercetin (приготовленные методом тонкопленочной гидратации) имели размер частиц 88.5 ± 2.6 nm с PDI 0.13 ± 0.04, эффективность инкапсуляции 82.5 ± 2.1% и дзета-потенциал −8.72 ± 1.03 mV.[7] Эта мицелла увеличила AUC0–∞ с 4633.71 ± 557.67 h·ng/mL (водная суспензия) до 41677.10 ± 4573.95 h·ng/mL, что было официально представлено как 9-кратное увеличение относительной пероральной биодоступности при более высокой Cmax (1920.83 ± 250.14 ng/mL против 628.67 ± 64.66 ng/mL) и отсроченном Tmax (7.3 ± 1.6 h против 3.0 ± 1.1 h).[7]
Второй подход к мицеллам quercetin использовал мицеллы Soluplus, приготовленные методом модифицированной дисперсии пленки (soluplus плюс F127), в которых теоретическая нагрузка препарата 7% обеспечивала размер частиц 79.00 ± 2.24 nm с PDI 0.154 ± 0.044, эффективность инкапсуляции 95.91% ± 4.05% и дзета-потенциал −17.10 ± 2.30 mV.[2] У собак породы бигль эти мицеллы увеличили время обнаружения quercetin с 24 h (свободный препарат) до 48 h (мицелла) и повысили Cmax с 5.24 μg·mL−1 до 7.56 μg·mL−1, при этом период полувыведения был в 2.19 раза больше, чем у чистого quercetin.[2]
Solid lipid and nanoparticle platforms
Помимо мицелл и липосом, набор данных включает в себя несколько платформ наночастиц, охватывающих полимерные наночастицы (PLGA), белковые наночастицы (на основе BSA), наночастицы на основе ионного гелеобразования chitosan, а также наносуспензии/нанокристаллы, каждая из которых снабжена подробными метриками размера и инкапсуляции.[1, 14–16] Наночастицы PLGA для fisetin были разработаны для оценки при внутривенном введении, при этом для примера рецептуры (NP4) сообщалось о среднем размере частиц ~330 nm, ζ-potential −7.2 mV, PDI 0.25, эффективности инкапсуляции 83.58% и нагрузке препарата 13.93%.[17] Вторая система наночастиц PLGA для fisetin (FST-NP) продемонстрировала средний размер 187.9 nm, PDI 0.121, ζ-potential −29.2 mV и эффективность инкапсуляции 79.3%, обеспечивая в 4.9, 3.2 и 2.3 раза более высокую проницаемость, чем суспензия, в модели вывернутого мешка кишечника в двенадцатиперстной, тощей и подвздошной кишках соответственно.[15]
Фолат-таргетные наночастицы fisetin (FFANPs) были описаны как монодисперсные сферические частицы размером 150 nm с PDI 0.117 и высокой эффективностью инкапсуляции (92.36% ± 3.84) при нагрузочной способности 8.39% ± 3.04, что подтверждает парадигму рецепторного таргетинга, а не парадигму пероральной экспозиции в рамках представленной выдержки.[14] Наночастицы fisetin на основе ионного гелеобразования chitosan/TPP (FNPs) имели средний размер 363.1 ± 17.2 nm и ζ-potential +17.7 ± 0.1 mV, при эффективности инкапсуляции 78.79 ± 7.7% и нагрузочной способности 37.46 ± 6.6%.[1]
Self emulsifying and nanoemulsion systems
В наборе данных описываются как концепции SNEDDS на уровне определений, так и конкретные системы наноэмульсий с результатами PK in vivo для fisetin, подчеркивающие влияние формуляции на кинетику абсорбции и эффективность дозы в моделях заболеваний.[5, 6] Для fisetin оптимизированный состав наноэмульсии (наноэмульсия 9) состоял из Miglyol 812 N (10%), Labrasol (10%), Tween 80 (2.5%), Lipoid E80 (1.2%), glycerol (2.25%), NaOH (0.1N) до pH 7 и воды до 100%, с диаметром наночастиц 146 ± 3 nm и очень низким PDI 0.015, зарегистрированным для препарата, содержащего Miglyol.[6] Эта же группа наноэмульсий характеризовалась диаметром капель 153 ± 2 nm, отрицательным ζ-potential −28.4 ± 0.6 mV и PDI 0.129; сообщалось, что наноэмульсия стабильна при 4 °C в течение 30 дней с фазовым разделением при 20 °C.[6]
С точки зрения фармакокинетики, внутривенное введение этой наноэмульсии fisetin в дозе 13 mg/kg не показало существенной разницы в системной экспозиции по сравнению со свободным fisetin, в то время как внутрибрюшинное введение обеспечило 24-кратное увеличение относительной биодоступности по сравнению со свободным fisetin, что объясняется более быстрой абсорбцией, отраженной в более коротком среднем времени абсорбции (MAT 1.97 h против 5.98 h).[6]
Для quercetin в одном исследовании SNEDDS описывался оптимизированный самонаноэмульгирующийся состав с использованием triacetin в качестве масляной фазы, Tween 20 в качестве сурфактанта и ethanol в качестве ко-сурфактанта, с размером частиц NE4 11.96 nm и высоким содержанием препарата (~97.98%–100.88%).[18]
Quantitative bioavailability gains
Литература, представленная здесь, подтверждает последовательную закономерность: нано/липидные системы доставки могут многократно изменять экспозицию по сравнению с традиционными растворами, суспензиями или неформулированными препаратами сравнения, причем кратные изменения AUC напрямую указываются во многих независимых исследованиях и обзорах.[3–5, 7–9] В таблице ниже обобщены зарегистрированные показатели кратности увеличения и основные конечные точки PK в точном соответствии с источниками, с использованием относительной биодоступности на основе AUC, где это применимо.
First pass and absorption constraints
Хотя в наборе данных пути печеночного метаболизма напрямую не квантифицируются, в нескольких исследованиях операционально демонстрируется, что формуляция может контролировать процесс и временной ход абсорбции, включая ускоренную абсорбцию (более короткое MAT) для внутрибрюшинно вводимой наноэмульсии fisetin и пролонгированную детектируемость для человеческого FF-20 по сравнению с неформулированным компаратором.[4, 6] Для quercetin многочисленные пероральные наноносители продлевают системное пребывание, включая наночастицы casein, которые поддерживали измеряемые уровни в плазме до 72 h (против 24 h для наночастиц без циклодекстрина), и мицеллы Soluplus, которые увеличили время обнаружения до 48 h по сравнению с 24 h для свободного препарата у собак.[2, 3] Данные также показывают, что наноносители могут смещать Tmax в любом направлении в зависимости от архитектуры системы, например, отсроченный Tmax у мицелл MPEG-b-PLLA с quercetin (7.3 h против 3.0 h) и сокращенный Tmax в эмульсии Пикеринга с quercetin (1.75 h против 3.33 h).[7, 19]
Analytical validation
Набор данных предоставляет обширные доказательства того, что количественная оценка наноформуляций флавоноидов в значительной степени опирается на жидкостную хроматографию (HPLC/UPLC) и LC-MS/MS с дополнительным использованием методов поглощения в УФ-видимой области и флуоресценции для характеристики составов и анализа содержания.[1, 4, 7, 9, 10, 13] В исследованиях фармакокинетики fisetin у человека для FF-20 fisetin и его метаболит geraldol определялись количественно с помощью UPLC-ESI-MS/MS (QTRAP) в режиме MRM с регистрацией отрицательных ионов после экстракции ацетонитрилом и фильтрации; содержание fisetin также измерялось с помощью валидированного анализа HPLC.[4] В исследованиях фармакокинетики мицелл quercetin у крыс метод тройного квадрупольного LC-MS/MS позволил количественно определить quercetin по переходу MRM m/z 301.1 → 151.0 с хроматографическим разделением на колонке Agilent Eclipse-C18 в изократическом режиме подвижной фазы вода/метанол.[7]
В нескольких работах по формуляциям использовались HPLC-UV или HPLC-DAD для анализа содержания и высвобождения/проницаемости, включая количественное определение наноэмульсии fisetin методом обращенно-фазовой HPLC с УФ-детектированием при 360 nm и количественное определение нагруженных quercetin наночастиц casein методом HPLC-UV с DAD при 370 nm.[3, 6] В некоторых системах применялась УФ-видимая спектрофотометрия для оценки концентрации fisetin или quercetin (например, fisetin при 364 nm для наночастиц chitosan; quercetin при 374 nm для растворения/содержания препарата в SNEDDS), а в одном исследовании липосомального fisetin концентрация fisetin определялась спектрофлуорометрически с возбуждением/эмиссией при 418/486 nm.[1, 10, 18]
Senescence and efficacy outcomes
Среди результатов на прямых моделях старения в наборе данных в настоящее время доминирует одно исследование in vitro, в котором тестировались fisetin и липосомы, нагруженные fisetin, на моделях doxorubicin-индуцированного старения; в нем ни свободный fisetin, ни липосомы с fisetin не вызывали селективного апоптоза стареющих клеток по сравнению с нестареющими в тестах на жизнеспособность.[10] Тем не менее, в том же исследовании сообщалось о сеноморфной активности, подтвержденной снижением секреции IL-6 и IL-8 в стареющих клетках, при этом как свободный, так и липосомальный fisetin позиционировались как модуляторы SASP согласно анализу ELISA.[10] Дополняя эти выводы, внешнее заявление о сенолитических свойствах in vivo, включенное в выдержки, гласит, что fisetin был признан самым мощным сенолитиком среди десяти флавоноидов, протестированных in vivo, снижая маркеры старения у прогероидных и старых мышей, однако в представленной цитате детали формуляции отсутствуют.[12]
Помимо конечных точек старения, многочисленные наноформуляции демонстрируют эффективность на моделях заболеваний, соответствующую улучшению экспозиции, включая наноэмульсию fisetin, достигшую 53% сокращения объема опухоли при дозе 36.6 mg/kg по сравнению с примерно в 6 раз более высокой дозой свободного fisetin (223 mg/kg) для аналогичного ингибирования роста опухоли у мышей с карциномой легких Льюиса.[6] Другие примеры эффективности, не связанные со старением, включают наносуспензию fisetin, улучшающую память и обучение и снижающую уровни MAO-A у мышей с деменцией, индуцированной Aβ(25–35), а также наночастицы fisetin на основе chitosan, снижающие мРНК воспалительных цитокинов (TNF-α и IL-6) и повышающие IL-10 в хондроцитах, предварительно обработанных IL-1β, предотвращая при этом снижение транскриптов, связанных с хрящом (Sox-9 и COL2).[1, 16]
Translational status
Набор данных включает в себя многочисленные исследования биодоступности составов fisetin и quercetin на добровольцах, что обеспечивает прямую трансляционную значимость утверждений об улучшении экспозиции.[4, 8] Для fisetin рандомизированный двойной слепой перекрестный дизайн с участием 15 здоровых добровольцев сравнивал дозу 1000 mg UF с 1000 mg FF-20 (содержащей 192 mg fisetin) с 10-дневным периодом отмывки, что позволило провести прямое внутрисубъектное сравнение PK, которое показало заметно более высокие AUC и Cmax для FF-20 и большую продолжительность обнаружения fisetin в плазме.[4] Для quercetin в неслепом перекрестном исследовании с участием 12 здоровых взрослых добровольцев оценивались три продукта quercetin; сообщалось, что жидкостная мицеллярная матрица LipoMicel обеспечила 8-кратное увеличение AUC и 9-кратное увеличение Cmax по сравнению со свободным quercetin, при Cmax 182.85 ng/mL и Tmax 0.5 h.[8]
Gaps and future directions
В рамках представленных доказательств ключевым пробелом является ограниченная связь между улучшением пероральной биодоступности и прямыми конечными точками элиминации стареющих клеток (например, селективным удалением стареющих клеток), поскольку единственный представленный здесь прямой эксперимент на модели старения показал сеноморфное снижение SASP без сенолитической селективности как для свободного fisetin, так и для липосом, нагруженных fisetin.[10] Еще один пробел заключается в том, что некоторые платформы сообщают о существенном улучшении биоаксессуарности или проницаемости (например, нанолипосомы fisetin повышают биоаксессуарность до 88.9–92.5% против 7.2% в неформулированном масле, а наночастицы PLGA с fisetin увеличивают кишечную проницаемость до 4.9 раза в модели вывернутого мешка кишечника) без параллельного подтверждения системной PK in vivo в приведенных выдержках.[13, 15]
Практическое будущее направление, вытекающее из представленных данных, заключается в более тесной интеграции характеристики формуляций с валидированными биоаналитическими измерениями, поскольку набор данных демонстрирует широкий методологический спектр — от LC-MS/MS и UHPLC-HRMS в клинической PK до анализов UV-Vis для оценки инкапсуляции или растворения при скрининге составов — что предполагает, что гармонизированные стратегии количественного определения могли бы улучшить сопоставимость исследований.[1, 4, 8, 18] Вторым будущим направлением является выбор формуляции, адаптированной к желаемым профилям абсорбции, поскольку исследования показывают как замедленный, так и ускоренный Tmax в зависимости от типа носителя (например, мицеллы MPEG-b-PLLA замедляют Tmax, в то время как эмульсии Пикеринга его сокращают), что подразумевает, что «лучшая» рецептура может варьироваться в зависимости от терапевтической цели и окна дозирования.[7, 19]
