Svladavanje paradoksa BCS klase IV u senoliticima: Nano-micelarna dostava hidrofobnih flavonoida za ciljano uklanjanje stanične senescencije
Sažetak
U dostupnoj literaturi fisetin i quercetin se učestalo pojavljuju kao bioaktivni flavonoidi čija je učinkovitost u stvarnim uvjetima ograničena izloženošću uvjetovanom formulacijom, pri čemu višestruki izvori eksplicitno opisuju slabu topljivost u vodi i nisku mjerljivu bioraspoloživost za konvencionalne pripravke ili otopine/suspenzije.[1–4] Višestruki pristupi temeljeni na nano- i lipidnim sustavima (liposomi, nanoliposomi, polimerne micele, nanosuspenzije, nanoemulzije, nanokohleati, SNEDDS) predstavljeni su kao praktične strategije za poboljšanje sistemske izloženosti i/ili kinetike apsorpcije, često uz velike kvantitativne dobitke u AUC ili relativnoj bioraspoloživosti.[3–9] Najsnažniji farmakokinetički signal kod ljudi u skupu podataka je hibridni sustav fisetina "micela u hidrogelu" (FF-20), koji je povećao fisetin AUC0–12h 26.9 puta i Cmax s 9.97 ng/mL na 238.2 ng/mL u usporedbi s neformuliranim komparatorom, dok je također produljio vremenski okvir u kojem se fisetin mogao kvantificirati u plazmi.[4]
Senolitičko obrazloženje
Unutar ovog skupa podataka, fisetin je eksplicitno definiran kao senoterapeutski ili senolitički flavonoid u više izvora, uključujući studiju koja je odabrala fisetin specifično kao „dobro proučen senoterapeutski lijek“ za testiranje u liposomima i preglednu izjavu da fisetin ima „senolitičke učinke“.[10, 11] Pretklinički in vivo dokazi navedeni u dostavljenim izvacima navode da je, među deset prirodnih flavonoida testiranih in vivo, fisetin prijavljen kao „najmoćniji senolitički spoj“, smanjujući markere senescencije kod progeroidnih i starih miševa.[12] Međutim, jedini izravni eksperiment na modelu senescencije uključen u skup podataka (doxorubicin-inducirana senescencija u A549 i WI38 stanicama) nije utvrdio selektivnu senolizu za slobodni fisetin ili liposomima punjen fisetin u testovima vijabilnosti, dok je i dalje opažena senomorfna modulacija SASP citokina IL-6 i IL-8 pomoću ELISA testa.[10]
Strategije liposomske inkapsulacije
Liposomski fisetin zastupljen je kroz više pristupa pripremi i karakterizaciji, uključujući metodu tankog sloja / tankog filma koristeći definirane fosfolipide i kolesterol, kao i platformu nanoliposoma isparavanjem tankog filma s opcionalnim premazom hijaluronske kiseline za stabilnost i ishode micelarizacije u fazi probave.[10, 13] U jednoj in vitro studiji senescencije, liposomi su pripremljeni miješanjem DOPC, DSPE i kolesterola u organskom otapalu, formiranjem lipidnog filma, rehidracijom u HEPES puferu i ekstruzijom kroz polikarbonatne membrane do 100 nm kako bi se dobili uniformni liposomi.[10] Ti su liposomi pokazali Z-prosjek 115.9 ± 0.9 nm (PDI 0.155 ± 0.004) i ζ-potencijal −20.3 ± 0.6 mV kada su bili prazni, dok je inkapsulacija fisetina smanjila veličinu na 95.1 ± 1.0 nm (PDI 0.178 ± 0.008) i pomaknula ζ-potencijal na −11.6 ± 1.2 mV, uz učinkovitost inkapsulacije od 13.68%.[10]
Zaseban sustav nanoliposoma koristio je lecithin i fisetin u masenom omjeru 25:1 s koncentracijom fisetina 0.8 mg/mL, proizveden isparavanjem tankog filma i ultrasonikacijom (2 min pri 40 W/cm²), dajući pravokutne nanoliposome od ~80 nm s PDI oko 0.3.[13] Premaz od hijaluronske kiseline (HA) pripremljen je otapanjem HA u fosfatnom puferu i miješanjem s nanoliposomima u volumnom omjeru 1:10 uz miješanje preko noći, a molekularna masa HA utjecala je na učinkovitost inkapsulacije (90–95% pri 3/35/90–100 kDa, smanjujući se na 79% pri 150–250 kDa i 74% pri 1000–1500 kDa).[13]
Polimerne i samookupljajuće micele
Polimerne micele eksplicitno su opisane u skupu podataka kao nanostrukturni sklopovi jezgra/ljuska formirani od amfifilnih blok kopolimera, a višestruki sustavi quercetin micela pružaju kvantitativna poboljšanja oralne PK. [2, 5, 7] Kod štakora, MPEG-b-PLLA quercetin micela (pripremljena hidratacijom tankog filma) imala je veličinu čestica 88.5 ± 2.6 nm s PDI 0.13 ± 0.04, učinkovitost inkapsulacije 82.5 ± 2.1% i zeta potencijal −8.72 ± 1.03 mV.[7] Ova micela povećala je AUC0–∞ s 4633.71 ± 557.67 h·ng/mL (vodena suspenzija) na 41677.10 ± 4573.95 h·ng/mL te je eksplicitno prijavljeno 9-struko povećanje relativne oralne bioraspoloživosti, uz viši Cmax (1920.83 ± 250.14 ng/mL naspram 628.67 ± 64.66 ng/mL) i odgođeni Tmax (7.3 ± 1.6 h naspram 3.0 ± 1.1 h).[7]
Drugi pristup quercetin micelama koristio je Soluplus micele pripremljene modificiranom disperzijom filma (soluplus plus F127), u kojoj je teoretsko opterećenje lijekom od 7% proizvelo veličinu čestica 79.00 ± 2.24 nm s PDI 0.154 ± 0.044, učinkovitost inkapsulacije 95.91% ± 4.05% i zeta potencijal −17.10 ± 2.30 mV.[2] Kod beagle pasa, ove su micele produljile mogućnost detekcije quercetina s 24 h (slobodni lijek) na 48 h (micela) i povećale Cmax s 5.24 μg·mL−1 na 7.56 μg·mL−1, uz prijavljeno poluvrijeme eliminacije 2.19 puta dulje od čistog quercetina.[2]
Platforme krutih lipida i nanočestica
Osim micela i liposona, skup podataka uključuje više platformi nanočestica koje obuhvaćaju polimerne nanočestice (PLGA), proteinske nanočestice (na bazi BSA), kitozanske nanočestice dobivene ionskim geliranje i nanosuspenzije/nanokristale, svaka s detaljnim metrikama veličine i inkapsulacije.[1, 14–16] PLGA nanočestice za fisetin razvijene su za evaluaciju usmjerenu na intravensku primjenu, s primjerom formulacije (NP4) kod koje je zabilježena srednja veličina čestica od ~330 nm, ζ-potencijal −7.2 mV, PDI 0.25, učinkovitost inkapsulacije 83.58% i opterećenje lijekom 13.93%.[17] Drugi sustav PLGA nanočestica za fisetin (FST-NP) prijavio je srednju veličinu 187.9 nm, PDI 0.121, ζ-potencijal −29.2 mV i učinkovitost inkapsulacije 79.3%, te je proizveo 4.9×, 3.2× i 2.3× veću permeaciju od suspenzije u modelu izvrnutog crijevnog segmenta kroz duodenum/jejunum/ileum.[15]
Folatno ciljane nanočestice fisetina (FFANPs) prijavljene su kao monodisperzne sferične čestice od 150 nm s PDI 0.117 i visokom učinkovitošću inkapsulacije (92.36% ± 3.84) uz kapacitet opterećenja 8.39% ± 3.04, podržavajući paradigmu ciljanja receptora radije nego paradigmu oralne izloženosti unutar dostavljenog izvatka.[14] Kitozan/TPP nanočestice fisetina dobivene ionskim geliranje (FNPs) imale su prosječnu veličinu 363.1 ± 17.2 nm i ζ-potencijal +17.7 ± 0.1 mV, uz učinkovitost inkapsulacije 78.79 ± 7.7% i kapacitet opterećenja 37.46 ± 6.6%.[1]
Samoemulgirajući sustavi i sustavi nanoemulzija
Skup podataka opisuje i SNEDDS koncepte na razini definicije i konkretne sustave nanoemulzija s in vivo PK ishodima za fisetin, naglašavajući kinetiku apsorpcije vođenu formulacijom i učinkovitost doze u modelima bolesti.[5, 6] Za fisetin, optimizirana formulacija nanoemulzije (nanoemulsion 9) bila je sastavljena od Miglyol 812 N (10%), Labrasol (10%), Tween 80 (2.5%), Lipoid E80 (1.2%), glicerola (2.25%), NaOH (0.1N) do pH 7 i vode do 100%, s promjerom nanočestica 146 ± 3 nm i vrlo niskim PDI 0.015 prijavljenim za pripravak koji sadrži Miglyol.[6] Ista obitelj nanoemulzija također je karakterizirana promjerom kapi od 153 ± 2 nm, negativnim ζ-potencijalom −28.4 ± 0.6 mV i PDI 0.129, a nanoemulzija je bila stabilna na 4 °C tijekom 30 dana uz odvajanje faza na 20 °C.[6]
Farmakokinetički, intravenska primjena ove nanoemulzije fisetina u dozi od 13 mg/kg nije pokazala značajnu razliku u sistemskoj izloženosti u usporedbi sa slobodnim fisetinom, dok je intraperitonealna primjena proizvela 24-struko povećanje relativne bioraspoloživosti u usporedbi sa slobodnim fisetinom, što se pripisuje bržoj apsorpciji odraženoj kroz kraće srednje vrijeme apsorpcije (MAT 1.97 h naspram 5.98 h).[6]
Za quercetin, jedna studija SNEDDS sustava opisala je optimiziranu samoemulgirajuću formulaciju koristeći triacetin kao uljnu fazu, Tween 20 kao surfaktant i etanol kao kosurfaktant, s NE4 veličinom čestica od 11.96 nm i prijavljenim visokim sadržajem lijeka (~97.98% do 100.88%).[18]
Kvantitativni porasti bioraspoloživosti
Ovdje citirana literatura podupire dosljedan obrazac: nano/lipidni sustavi dostave mogu pomaknuti izloženost za višekratnike u odnosu na konvencionalne otopine, suspenzije ili neformulirane komparatore, s faktorima promjene koji su izravno navedeni u više neovisnih studija i pregleda.[3–5, 7–9] Tablica u nastavku objedinjuje prijavljene faktore povećanja i ključne PK ishode točno onako kako su navedeni u izvorima, koristeći relativnu bioraspoloživost temeljenu na AUC-u gdje je dostupna.
Ograničenja prvog prolaza i apsorpcije
Iako skup podataka ne kvantificira izravno putove jetrenog metabolizma, nekoliko studija operativno pokazuje da formulacija može kontrolirati proces apsorpcije i tijek vremena, uključujući bržu apsorpciju (kraći MAT) za intraperitonealno primijenjenu nanoemulziju fisetina i produljenu mogućnost detekcije za ljudski FF-20 u usporedbi s neformuliranim komparatorom.[4, 6] Za quercetin, višestruki oralni nanonosači produljuju sistemsku prisutnost, uključujući kazeinske nanočestice koje su održavale mjerljive razine u plazmi do 72 h (naspram 24 h za stanje nanočestica bez ciklodekstrina) i Soluplus micele koje su produljile detekciju na 48 h u usporedbi s 24 h za slobodni lijek kod pasa.[2, 3] Podaci također pokazuju da nanonosači mogu pomaknuti Tmax u bilo kojem smjeru ovisno o arhitekturi sustava, kao što je odgođeni Tmax u MPEG-b-PLLA quercetin micelama (7.3 h naspram 3.0 h) i skraćeni Tmax u quercetin Pickering emulziji (1.75 h naspram 3.33 h).[7, 19]
Analitička validacija
Skup podataka pruža opsežne dokaze da se kvantitativna evaluacija nanoformulacija flavonoida uvelike oslanja na tekućinsku kromatografiju (HPLC/UPLC) i LC-MS/MS, uz dodatnu upotrebu UV-Vis apsorbancije i fluorescentnih metoda za karakterizaciju formulacije i testove sadržaja.[1, 4, 7, 9, 10, 13] U farmakokinetici fisetina kod ljudi za FF-20, fisetin i njegov metabolit geraldol kvantificirani su korištenjem UPLC-ESI-MS/MS (QTRAP) u MRM načinu rada s negativnim ionima nakon ekstrakcije acetonitrilom i filtracije, a sadržaj fisetina također je izmjeren validiranom HPLC analizom.[4] U farmakokinetici quercetin micela kod štakora, metoda trostrukog kvadrupola LC-MS/MS kvantificirala je quercetin pomoću MRM prijelaza m/z 301.1 → 151.0 s kromatografskim razdvajanjem na Agilent Eclipse-C18 koloni pod izokratičnom mobilnom fazom voda/metanol.[7]
Nekoliko radova o formulacijama koristilo je HPLC-UV ili HPLC-DAD za ispitivanje sadržaja i oslobađanja/permeacije, uključujući kvantifikaciju nanoemulzije fisetina pomoću HPLC-a s obrnutim fazama uz UV detekciju na 360 nm i kvantifikaciju kazeinskih nanočestica punjenih quercetinom pomoću HPLC-UV s DAD-om na 370 nm.[3, 6] Neki sustavi koristili su UV-Vis spektrofotometriju za procjenu koncentracije fisetina ili quercetina (npr. fisetin na 364 nm za kitozanske nanočestice; quercetin na 374 nm za SNEDDS otapanje/sadržaj lijeka), a jedna studija liposomskog fisetina kvantificirala je koncentraciju fisetina spektrofluorometrijom s ekscitacijom/emisijom na 418/486 nm.[1, 10, 18]
Ishodi senescencije i učinkovitosti
Izravni ishodi na modelima senescencije u skupu podataka trenutno su pod dominacijom jedne in vitro studije koja je testirala fisetin i liposomima punjen fisetin u doxorubicin-induciranim modelima senescencije, u kojoj ni slobodni fisetin ni liposomima punjen fisetin nisu proizveli selektivnu apoptozu senescentnih nad nesenescentnim stanicama u testovima vijabilnosti.[10] Isti rad je ipak izvijestio o senomorfnoj aktivnosti dokazanoj smanjenim lučenjem IL-6 i IL-8 u senescentnim stanicama te je definirao i slobodni i liposomski fisetin kao modulatore SASP-a putem ELISA analize.[10] Nadopunjujući ove nalaze, vanjska in vivo tvrdnja o senolitičkom djelovanju uključena u izvatke navodi da je fisetin prijavljen kao najmoćniji senolitik među deset flavonoida testiranih in vivo, smanjujući markere senescencije kod progeroidnih i starih miševa, ali bez detalja o formulaciji u dostavljenom skupu citata.[12]
Izvan ishoda senescencije, višestruke nanoformulacije pokazuju učinkovitost u modelima bolesti u skladu s poboljšanjima izloženosti, uključujući nanoemulziju fisetina koja postiže 53% smanjenja volumena tumora pri 36.6 mg/kg naspram ~6 puta veće doze slobodnog fisetina (223 mg/kg) za sličnu inhibiciju rasta tumora kod miševa s Lewisovim karcinomom pluća.[6] Ostali primjeri učinkovitosti koji se ne odnose na senescenciju uključuju nanosuspenziju fisetina koja poboljšava pamćenje i učenje te smanjuje razine MAO-A kod miševa s demencijom induciranom Aβ(25–35), te kitozanske nanočestice fisetina koje smanjuju mRNA upalnih citokina (TNF-α i IL-6) i povećavaju IL-10 u hondrocitima prethodno tretiranim s IL-1β, uz sprječavanje smanjenja transkripata povezanih s hrskavicom (Sox-9 i COL2).[1, 16]
Translacijski status
Skup podataka uključuje višestruke studije bioraspoloživosti na dobrovoljcima za formulacije fisetina i quercetina, pružajući izravnu translacijsku važnost za tvrdnje o poboljšanju izloženosti.[4, 8] Za fisetin, randomizirani, dvostruko slijepi, unakrsni dizajn u 15 zdravih dobrovoljaca usporedio je dozu od 1000 mg UF s 1000 mg FF-20 (isporučujući 192 mg fisetina) s 10-dnevnim razdobljem ispiranja, omogućujući izravnu PK usporedbu unutar istog ispitanika koja je pokazala znatno viši AUC i Cmax za FF-20 i dulje trajanje fisetina u plazmi koje se može kvantificirati.[4] Za quercetin, ne-slijepa unakrsna studija u 12 zdravih odraslih dobrovoljaca procijenila je tri proizvoda quercetina i izvijestila da je tekuća micelarna matrica LipoMicel postigla 8-struko povećanje AUC i 9-struko povećanje Cmax u usporedbi sa slobodnim quercetinom, s Cmax od 182.85 ng/mL pri Tmax 0.5 h.[8]
Nedostaci i smjerovi budućih istraživanja
Unutar granica pruženih dokaza, ključni nedostatak je ograničena povezanost poboljšanja oralne bioraspoloživosti s izravnim ishodima uklanjanja senescencije (npr. selektivna eliminacija senescentnih stanica), jer je jedini eksplicitni eksperiment na modelu senescencije ovdje pokazao senomorfno smanjenje SASP-a bez senolitičke selektivnosti i za slobodni fisetin i za liposomima punjen fisetin.[10] Drugi nedostatak je taj što neke platforme izvješćuju o značajnim poboljšanjima bioraspoloživosti ili permeacije (npr. nanoliposomi fisetina povećavaju biodostupnost na 88.9–92.5% naspram 7.2% u ulju, a PLGA nanočestice fisetina povećavaju crijevnu permeaciju do 4.9× u modelu izvrnutog crijevnog segmenta) bez paralelne in vivo sistemske PK potvrde u ovdje dostavljenim izvacima.[13, 15]
Praktični budući smjer impliciran dokazima je čvršća integracija karakterizacije formulacije s validiranim bioanalitičkim mjerenjima, budući da skup podataka pokazuje širok metodološki spektar — od LC-MS/MS i UHPLC-HRMS u kliničkoj PK do UV-Vis testova za inkapsulaciju ili otapanje u probiru formulacija — sugerirajući da bi usklađene strategije kvantifikacije mogle poboljšati usporedivost među studijama.[1, 4, 8, 18] Drugi smjer u budućnosti je odabir formulacije prilagođen željenim profilima apsorpcije, jer studije pokazuju i odgođeni i ubrzani Tmax ovisno o vrsti nosača (npr. MPEG-b-PLLA micele odgađaju Tmax naspram Pickering emulzija koje ga skraćuju), što implicira da se „najbolja“ formulacija može razlikovati ovisno o terapijskom cilju i prozoru doziranja.[7, 19]
